Functional background of mitochondrial genome evolution unraveled from the atp8 gene of Polypedates leucomystax

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【計画１】ゲノム編集によるネッタイツメガエルMitoゲノム変異体の作出ヒトミトコンドリア局在配列がツメガエル細胞で十分機能することをツメガエル培養細胞で確認したのち、ミトコンドリア局在型Cas9とRP-loop付きsgRNAをツメガエル胚に顕微注入したが、ミトコンドリアゲノムに変異が導入された形跡は認められなかった。また、RP-loop配列のミトコンドリア局在に対する有効性を調べるためにヒト培養細胞やツメガエル培養細胞を用いたRNAトランスフェクション実験を行ったが、RP-loopなしでもミトコンドリア画分から大量のsgRNAが検出されてしまったので、実験系の再検討が必要となった。なお、抗Cox4抗体を用いることでツメガエルミトコンドリアを抗体染色にて可視化する方法も確立した。【計画２】MITO-Porterを用いたMitoゲノム遺伝子の機能解析ミトコンドリア用に遺伝子コードを改変したmVenus mRNAを作成し、MITO-Porterに封入してツメガエル胚に顕微注入したが、蛍光観察・ウェスタンブロッティングどちらでも発現を認められなかった。また、MITO-Porterに導入した蛍光色素を観察しても、明瞭なミトコンドリアへの局在は確認できなかった。【計画３】シロアゴガエル全ゲノム配列の解読一分子ロングリードシークエンサー（PacBio Sequel II HiFiリード）を用いて、シロアゴガエルの全ゲノム解読を行った結果、良好なゲノムアセンブリが得られた（Scaffod N50=1.46Mb, complete BUSCOs=94.8%）。トランスクリプトームデータと合わせて解析した結果、シロアゴガエルミトコンドリア関連遺伝子には目立った重複がないこと、atp8遺伝子が核に移行した形跡はないこと、これまで偽遺伝子だと思われてきたatp8が十分に転写されていることを明らかにした。