リソソームのターンオーバーと数に関する制御機構

本年度は、昨年度に引き続きオートファジー関連遺伝子EPG5の機能を、オートファジー経路のどこに働いているのかおよびリソソーム機能に与える影響をセルラインとゲノム編集を用いた方法で評価した。これまでEPG5に変異のあるVici症候群患者皮膚線維芽細胞を用いた解析およびHeLa細胞でsiRNAを用いたEPG5のノックダウン実験を行い、オートファジー機能の低下が観察されていた。しかしエンドサイトーシスの機能は全く正常であった。細胞の懸濁液で評価したリソソーム酵素活性は正常か軽度低下に留まり、リソソームの分解機能に障害を与えるほど（～10%以下）の低下は認めず、数の変化も明らかではなかった。本年度はsiRNAで用いたものと同じHeLa細胞に対してCRISPR/Cas9を用いてEPG5遺伝子を破壊し、オートファジー及びエンドサイトーシスの評価を行った。皮膚線維芽細胞やノックダウンで認められたオートファジーの障害と正常なエンドサイトーシスはノックアウト細胞でも同様の結果を示した。さらに皮膚線維芽細胞やノックダウンにてはっきりしなかったEPG5のオートファジーへの作用点に関しては、オートファゴソームのマーカーであるLC3とリソソームのマーカーであるLamp1の共局在、オートファゴソームとリソソームの融合を酸性度で評価するtfLC3などを用いて、最終的にEPG5はオートファゴソームとリソソームの融合に働いている事を明らかにした。同様の結果は海外のグループからも確認されたが、我々の研究ではエンドサイトーシスが正常である点において未だ意見の相違がある。本研究結果は申請者を（共）筆頭著者として現在論文を投稿中である。

本年度は、昨年度に引き続きオートファジー関連遺伝子EPG5の機能を、オートファジー経路のどこに働いているのかおよびリソソーム機能に与える影響をセルラインとゲノム編集を用いた方法で評価した。これまでEPG5に変異のあるVici症候群患者皮膚線維芽細胞を用いた解析およびHeLa細胞でsiRNAを用いたEPG5のノックダウン実験を行い、オートファジー機能の低下が観察されていた。しかしエンドサイトーシスの機能は全く正常であった。細胞の懸濁液で評価したリソソーム酵素活性は正常か軽度低下に留まり、リソソームの分解機能に障害を与えるほど（～10%以下）の低下は認めず、数の変化も明らかではなかった。本年度はsiRNAで用いたものと同じHeLa細胞に対してCRISPR/Cas9を用いてEPG5遺伝子を破壊し、オートファジー及びエンドサイトーシスの評価を行った。皮膚線維芽細胞やノックダウンで認められたオートファジーの障害と正常なエンドサイトーシスはノックアウト細胞でも同様の結果を示した。さらに皮膚線維芽細胞やノックダウンにてはっきりしなかったEPG5のオートファジーへの作用点に関しては、オートファゴソームのマーカーであるLC3とリソソームのマーカーであるLamp1の共局在、オートファゴソームとリソソームの融合を酸性度で評価するtfLC3などを用いて、最終的にEPG5はオートファゴソームとリソソームの融合に働いている事を明らかにした。同様の結果は海外のグループからも確認されたが、我々の研究ではエンドサイトーシスが正常である点において未だ意見の相違がある。本研究結果は申請者を（共）筆頭著者として現在論文を投稿中である。