固液界面で機能する核酸－酵素ハイブリッド分子の創製とその高度利用

在固液界面发挥作用的核酸-酶杂化分子的创建及其高级利用

基本信息

批准号：
14J04260
负责人：
高原茉莉
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究においては機能性生体分子であるDNAアプタマーとタンパク質に注目し、その二機能を合わせもつDNA-タンパク質ハイブリッド分子の創製及び応用を行っている。DNAアプタマーとは、標的分子に対して特異的に結合する機能性一本鎖核酸である。タンパク質は発光特性、触媒特性など多様な機能を有し、分子認識機能を有するDNAアプタマーへタンパク質をハイブリッド化すると、標的分子に対してDNA-タンパク質複合体を穏やかな条件で配置することができる。即ちハイブリッド分子により、カスケード反応場やナノ構造体を容易に構築可能である。このような応用を視野に入れた場合、ハイブリッド化において双方の機能性を最大にする必要がある。そこで報告者は、二種類の異なる酵素反応、ターミナルトランスフェラーゼ (TdT) 及び微生物由来トランスグルタミナーゼ (MTG) の基質特異性に着目し、部位特異的かつ高効率な複合化を進行させ、最終産物の機能損失を最小にする系を構築した。昨年度から引き続き、まず、DNAアプタマーを用いた人工酵素を開発した。モデルとしたのは、セルロース系バイオマスの加水分解を触媒するセルラーゼである。報告者が最適化した手法でセルラーゼ (触媒ドメイン) とセルロース結合性アプタマーの複合化を行い、固体セルロース基質の加水分解反応へと応用して天然のセルラーゼに匹敵する機能性を確認した。さらに、天然型のセルラーゼと異なり、塩濃度に応答して活性がスイッチングする性質を発見し、その塩濃度依存性の結合特性を詳細に解析した。並行して、癌細胞イメージング試薬の開発を行い、新たなハイブリッド化法を検証した。新規ハイブリッド化法では、MTGの基質として、DNA側を一級アミン、タンパク質側をグルタミン (Gln) として、基質の最適を行い、汎用的、効率的かつハイブリッド分子の精製が容易な手法を目指した。

在这项研究中，我们专注于功能性生物分子DNA适体和蛋白质，并创建并应用了结合这两个功能的DNA-蛋白质混合分子。 DNA适体是一种功能性的单链核酸，该核酸特异性与靶分子结合。蛋白质具有多种功能，例如发光和催化特性，当蛋白质与具有分子识别功能的DNA适体杂交时，可以将DNA蛋白质复合物与靶分子相对于温和条件。也就是说，混合分子可以轻松构建级联反应场和纳米结构。当考虑此类应用时，有必要最大化两者在杂交中的功能。因此，重点是两个不同酶反应的底物特异性，末端转移酶（TDT）和微生物转谷氨酰胺酶（MTG），并构建了一个系统，该系统以特定地点特异性且高效的共轭进行进行，最小化最终产品的功能损失。从去年开始，我们首先使用DNA适体开发了人工酶。该模型是纤维素生物量催化水解的纤维素酶。将记者优化了纤维素酶（催化结构域）和纤维素结合的适体与纤维素结合的适体共轭，并将其应用于固体纤维素底物的水解反应，以确认功能与自然纤维素酶的功能相当。此外，与天然纤维素酶不同，发现对盐浓度的转换活性，并详细分析了盐浓度依赖性的结合特性。同时，开发了癌细胞成像试剂以验证新的杂交方法。在新型杂交方法中，通过使用DNA侧作为MTG的底物，将蛋白质侧用作主要胺和蛋白质侧作为底物，优化了底物，从而实现了通用，有效的方法，可以轻松纯化混合分子。