小分子によるＲＮＡシュードノット構造の形成と遺伝子発現制御への応用

これまでに合成小分子NCTnがRNA中のCGG/CGG配列に特異的に結合することによりシュードノット構造を誘起し、さらに誘起されたシュードノット構造により－1リボソームフレームシフト（－1PRF）が引き起こされ、下流の遺伝子が発現することをin vitroと細胞内の両方で実証してきた。本年度はNCTn誘起型－１PRFのカイネティクス解析を行った。クエンチフローシステムを用いて翻訳時間0.05秒～200秒で産出するペプチド鎖を調べたところ、NCT8結合配列であるCGG/CGG配列をもつmRNAに対しては、NCT8非存在下と比べてNCT8を添加したときに、０フレーム産物より－１フレーム産物の生成速度が速いことが示された。また、これまでにRT-PCRによる細胞内RNAの定量解析により、NCT添加から12～24時間の間にNCT8の副次的な影響が出ていることが示唆されていた。そこで本年度は、次世代シーケンサーを用いたRNA-seqにより、NCT8の添加により細胞内のトランスクリプトームがどのように変動するのかを解析した。その結果、化合物添加後１２時間及び２４時間後に発現促進及び発現抑制した遺伝子が見つかった。プロモーター領域をTSSの上流５００塩基と定義し、配列解析を行ったところ、NCT8により遺伝子の発現が上昇した遺伝子のプロモーター領域にはGCリッチな配列が多いことが明らかになった。SPR解析によりNCT8とプロモーター領域により多く発見された４塩基を持つDNAとの相互作用が確認できた。一方、プロモーター領域で発見頻度の低い４塩基をもつDNAではNCTとの相互作用は観測されなかった。このことから、NCTがGCリッチなプロモーター配列と相互作用することにより、遺伝子発現を上昇させる可能性が示唆された。

これまでに合成小分子NCTnがRNA中のCGG/CGG配列に特異的に結合することによりシュードノット構造を誘起し、さらに誘起されたシュードノット構造により－1リボソームフレームシフト（－1PRF）が引き起こされ、下流の遺伝子が発現することをin vitroと細胞内の両方で実証してきた。本年度はNCTn誘起型－１PRFのカイネティクス解析を行った。クエンチフローシステムを用いて翻訳時間0.05秒～200秒で産出するペプチド鎖を調べたところ、NCT8結合配列であるCGG/CGG配列をもつmRNAに対しては、NCT8非存在下と比べてNCT8を添加したときに、０フレーム産物より－１フレーム産物の生成速度が速いことが示された。また、これまでにRT-PCRによる細胞内RNAの定量解析により、NCT添加から12～24時間の間にNCT8の副次的な影響が出ていることが示唆されていた。そこで本年度は、次世代シーケンサーを用いたRNA-seqにより、NCT8の添加により細胞内のトランスクリプトームがどのように変動するのかを解析した。その結果、化合物添加後１２時間及び２４時間後に発現促進及び発現抑制した遺伝子が見つかった。プロモーター領域をTSSの上流５００塩基と定義し、配列解析を行ったところ、NCT8により遺伝子の発現が上昇した遺伝子のプロモーター領域にはGCリッチな配列が多いことが明らかになった。SPR解析によりNCT8とプロモーター領域により多く発見された４塩基を持つDNAとの相互作用が確認できた。一方、プロモーター領域で発見頻度の低い４塩基をもつDNAではNCTとの相互作用は観測されなかった。このことから、NCTがGCリッチなプロモーター配列と相互作用することにより、遺伝子発現を上昇させる可能性が示唆された。