エピゲノムマーキングによるキスペプチン発現制御メカニズムの解明

視床下部サンプルにおけるエンハンサー特異的なヒストン修飾のクロマチン免疫沈降解析を行い、UCSCゲノムブラウザーへマッピングを行った。その結果、マウスゲノム上に1000-2400カ所程度のエンハンサー特異的ヒストン修飾の豊富な領域があることがわかった。一方、これら領域にはKiss1遺伝子座は含まれていなかった。ARCのKiss1遺伝子エンハンサー候補領域10 kb内を詳しく調べると、ARCサンプルではエンハンサー特異的ヒストン修飾を受け、なおかつAVPVサンプルでは修飾を受けていない領域が存在していた。しかし、マッピングされたシグナルの絶対数が少なく、真のシグナルかどうか判断が困難であった。その原因はサンプルがキスペプチンニューロン以外の細胞を多く含んでいるためであると考えられる。そこで、キスペプチンニューロンに緑色蛍光タンパクを発現するKiss1-GFPマウスの胎児視床下部を初代培養しSV40T-antigenによって不死化を試みた。一度継代後、SV40T-antigenを導入すると緑色蛍光は消失したが、不死化自体には成功した。不死化細胞を単一クローンに分離して、クローン化を行い、複数のKiss1-GFPマウス由来の不死化細胞株を得ることに成功した。CRISPR/Casシステムを所属研究室にて確立し、視床下部不死化細胞においてCRISPRを使ってKiss1遺伝子プロモーター付近にエピジェネィック修飾タンパク質p300を強制発現させると、Kiss1発現が上昇した。よって、キスペプチンの発現制御には少なくともエピジェネティック修飾タンパクp300が関連することが示唆された。

視床下部サンプルにおけるエンハンサー特異的なヒストン修飾のクロマチン免疫沈降解析を行い、UCSCゲノムブラウザーへマッピングを行った。その結果、マウスゲノム上に1000-2400カ所程度のエンハンサー特異的ヒストン修飾の豊富な領域があることがわかった。一方、これら領域にはKiss1遺伝子座は含まれていなかった。ARCのKiss1遺伝子エンハンサー候補領域10 kb内を詳しく調べると、ARCサンプルではエンハンサー特異的ヒストン修飾を受け、なおかつAVPVサンプルでは修飾を受けていない領域が存在していた。しかし、マッピングされたシグナルの絶対数が少なく、真のシグナルかどうか判断が困難であった。その原因はサンプルがキスペプチンニューロン以外の細胞を多く含んでいるためであると考えられる。そこで、キスペプチンニューロンに緑色蛍光タンパクを発現するKiss1-GFPマウスの胎児視床下部を初代培養しSV40T-antigenによって不死化を試みた。一度継代後、SV40T-antigenを導入すると緑色蛍光は消失したが、不死化自体には成功した。不死化細胞を単一クローンに分離して、クローン化を行い、複数のKiss1-GFPマウス由来の不死化細胞株を得ることに成功した。CRISPR/Casシステムを所属研究室にて確立し、視床下部不死化細胞においてCRISPRを使ってKiss1遺伝子プロモーター付近にエピジェネィック修飾タンパク質p300を強制発現させると、Kiss1発現が上昇した。よって、キスペプチンの発現制御には少なくともエピジェネティック修飾タンパクp300が関連することが示唆された。