創薬ターゲット蛋白質細胞内１分子スクリーニング法の開発

药物发现靶蛋白的细胞内单分子筛选方法的开发

• 批准号: 15J01482
• 负责人: 出川 拓馬
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J01482/
• 关键词: PTEN; ArfGTPase; GPCR; 相互作用解析; １分子イメージング; GTPase; Arf; 細胞運動; ケミカルバイオロジー

本年度はPTENの結合タンパク質の候補であった低分子量型Gタンパク質ArfAが、PTENと生化学的に相互作用することをプルダウンアッセイによって明らかにしたが、昨年度の報告の通り、本研究で提案している細胞内１分子イメージングを用いた分子間相互作用検出法では、PTENとArfAの結合を確認することができなかった。この手法ではArfAを膜貫通タンパク質に融合させ、膜貫通タンパク質をガラスに固定化する。ArfAの膜貫通タンパク質を介したガラス固定化に伴い、１分子イメージングにより明らかになるPTENの拡散係数が小さくなれば、両分子の間の相互作用が認められるというアイディアである。実際にはPTENとArfAとの間には生化学的な相互作用が存在するが、この手法で検出できなかった理由として、ArfAに融合していた膜貫通タンパク質の細胞質領域の長さが適当でなかったことが考えられる。細胞質領域の長さを最適化することで、形質膜上での２分子間の相互作用が１分子イメージングにより捉えられると期待される。また、ガラスにリガンドを固相化することで、細胞表面に発現するレセプターとリガンドの相互作用を１分子イメージングにより検出する手法も提案していた。モデルケースとして、葉酸と葉酸レセプターの相互作用を本研究が提案する手法で検出できるかを検討したが、リガンド固相化に伴うガラス表面の蛍光を発する物質による汚染が著しく、葉酸レセプターの１分子イメージングを行うに堪えなかった。固相化試薬に由来する汚染であると考えらえるが、ポリエチレングリコールによる修飾によりガラス面への蛍光物質の非特異的な吸着は抑えられると期待される。リガンド固相化のための官能基を備えたポリエチレングリコールも商用化されているので、ポリエチレングリコール修飾によって、１分子イメージングが可能なリガンド固相化ガラスの作製を目指したい。

今年，我们通过下拉测定法揭示了低分子量G蛋白ARFA（是PTEN结合蛋白结合蛋白的候选者）与PTEN上的生物化学相互作用，但是正如去年所报道的那样，在该研究中，使用静脉相互作用检测方法提出了PTEN与ARFA的结合，并未证实使用Interacular interaclolar interacell interacell sisse nimbalular Single-morecule fime。在这种技术中，ARFA融合到跨膜蛋白上，将跨膜蛋白固定在玻璃上。这个想法是，如果通过单分子成像揭示的PTEN的扩散系数随着通过跨膜蛋白的玻璃固定化而变小，则可以观察到这两个分子之间的相互作用。实际上，PTEN和ARFA之间存在生化相互作用，但是无法检测到该方法的原因是，互构成与ARFA的跨膜蛋白的细胞质区域的长度不合适。通过优化细胞质区域的长度，可以预期可以通过单分子成像捕获质膜上两个分子之间的相互作用。此外，已经提出了一种方法，其中将配体固定在玻璃上以检测受体与通过单分子成像在细胞表面表达的配体之间的相互作用。作为模型案例，我们研究了使用本研究提出的方法可以检测到叶酸与叶酸受体之间的相互作用，但是由配体固定引起的玻璃表面荧光受污染是显着的，并且很难对叶酸受体的单分子成像进行单分子成像。尽管认为它是源自固相试剂的污染物，但预计用聚乙烯乙二醇修饰会抑制荧光物质在玻璃表面上的非特异性吸附。与配体固定的官能团的聚乙烯乙二醇也已商业化，因此我们希望通过修饰聚乙烯甘氨酸来产生可以在单分子中成像的配体固定玻璃。

项目成果

ArfGTPase reguates PTEN recruitment to the plasma membrane in eukaryotic chemotaxis

ArfGTPase 调节真核趋化过程中 PTEN 向质膜的募集

• 发表时间: 2017
• 作者: Degawa Takuma;Morimoto Yusuke;Yoichiro kamimura;Matsuoka Satomi;Ueda Masahiro
• 通讯作者: Ueda Masahiro

Self-organized Arf activation regulates cell migration through PTEN recruitment to the plasma membrane

自组织 Arf 激活通过 PTEN 募集到质膜来调节细胞迁移

• 发表时间: 2016
• 作者: 出川拓馬;松岡里実;上村陽一郎;上田昌宏
• 通讯作者: 上田昌宏

Polarized ArfA activation directs PTEN to posterior plasma membrane for eukaryotic cell migration

极化 ArfA 激活将 PTEN 引导至后质膜以进行真核细胞迁移

• 发表时间: 2017
• 作者: 出川 拓馬;松岡 里実;上村 陽一郎;上田 昌宏
• 通讯作者: 上田 昌宏

低分子量Gタンパク質Arfによる走化性応答の制御

低分子量 G 蛋白 Arf 对趋化反应的调节

• 发表时间: 2016
• 作者: 出川拓馬;松岡里実;上村陽一郎;上田昌宏
• 通讯作者: 上田昌宏

PTENを介したArfGTPaseによる細胞運動の制御機構

PTEN介导的ArfGTPase控制细胞运动的机制

• 发表时间: 2017
• 作者: 出川 拓馬;松岡 里実;森本 雄祐;上村 陽一郎;上田 昌宏
• 通讯作者: 上田 昌宏