回転拡散を利用したタンパク質反応ダイナミクス測定法の開発とその応用

旋转扩散蛋白质反应动力学测量方法的建立及其应用

• 批准号: 15J02073
• 负责人: 吉武 智之
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J02073/
• 关键词: 蛍光異方性解消法; タンパク質変性; 回転拡散; タンパク質構造; タンパク質; 回転拡散係数; 異方性解消法; 反応ダイナミクス

(1)1残基のシステインを導入した６つのLysozyme変異体(K19C, S39C, S46C, N55C, V131C)に対して蛍光色素Setau-425-maleimide(以下Setau)を用いて選択的にラベリングを行ったサンプルに対し、CD測定スペクトル測定及び蛍光異方性解消法による測定を行うことでタンパク質の変性曲線に沿った局所部位の回転緩和速度の挙動を調べた。その結果、CD測定により得られた各変異体の変性曲線にはほとんど違いが見られなかった。一方、局所部位の回転緩和速度の挙動は変異体によって異なることがわかった。この結果はラベリングした局所構造の壊れやすさ、及び壊れた後の構造の動きやすさが局所構造ごとに異なることを反映していると考えられ、各局所構造を平均化した情報からは得られない挙動を捉えている考えられる。しかし、結果に対応する具体的な分子論的な描像は得られておらず、今後ラベリング箇所を増やして測定を行いタンパク質構造のより広範な領域の情報を得る必要がある。(2)蛍光異方性解消法をタンパク質反応ダイナミクス観測に適応するためにはデータ取得に要する時間をできるだけ短くする必要があるため、ストリークカメラを導入し、単一光子計数法による測定からアナログ測定に切り替えることで、データ取得時間を最短4ミリ秒まで短縮した。ストップトフローシステムは所属研究室で開発中のものを用いた。測定デッドタイム計測の結果からミリ秒程度の時間スケールでは、回転緩和速度は溶液混合後の流れの影響をほとんど受けないことがわかった。しかし、本システムには2液の混合比率が不安定、測定セル内の溶液が一回の混合で完全に交換されないという問題があり、現在改良を行っている。上記の問題を解決後、各Lysozyme変異体のリフォールディング反応ダイナミクス計測を行いたいと考えている。

(1)1 The introduction of residues into six Lysozyme variants (K19C, S39C, S46C, N55C, V131C) was used to adjust the rate of regression of the photochrome Setau-425-maleimide(hereinafter Setau) along the quality curve. The results and CD measurements were obtained from the different curves. The speed of rotation of a party and a bureau is different. The result is that the structure of each office is different from that of the other office, and the information is averaged. For example, the results of the specific molecular theory of the image obtained in the future, the determination of the quality of the structure of the field of information necessary (2)The optical anisotropy method is used to determine the quality of the sample. The time required to obtain the sample is shortened by 4 seconds. The research team is responsible for the development of the project. The measurement results show that the flow rate of the solution after mixing is affected by the temperature and temperature of the solution. The mixing ratio of the two solutions in the system is unstable, and the solution in the system is completely exchanged. After solving the above problem, the Lysozyme variant was detected in the middle of the test

项目成果

Rotational diffusion coefficients and the fluctuation of local structure of proteins along denaturation curve 蛍光異方性解消法を用いたタンパク質の構造変性時における回転拡散係数および局所構造動きに関する研究

旋转扩散系数和蛋白质局部结构沿去饱和曲线的波动利用荧光各向异性抵消法研究蛋白质结构变性过程中的旋转扩散系数和局部结构运动

• 发表时间: 2017
• 作者: Tomoyuki Yoshitake;Tsuguyoshi Toyooka;Yusuke Nakasone;Kazunori Zikihara;Satoru Tokutomi;Masahide Terazima;吉武智之
• 通讯作者: 吉武智之

回転拡散係数に対するタンパク質の二次構造変化の影響

蛋白质二级结构变化对旋转扩散系数的影响

• 发表时间: 2016
• 作者: 吉武智之;寺嶋正秀
• 通讯作者: 寺嶋正秀

Macromolecular crowding effect for photoreactions of LOV2 domains of Arabidopsis thaliana phototropin 1

拟南芥趋光素1 LOV2结构域光反应的大分子拥挤效应

• DOI: 10.1016/j.molliq.2015.08.030
• 发表时间: 2016
• 期刊: Journal of Molecular Liquids
• 影响因子: 6
• 作者: Tomoyuki Yoshitake;Tsuguyoshi Toyooka;Yusuke Nakasone;Kazunori Zikihara;Satoru Tokutomi;Masahide Terazima
• 通讯作者: Masahide Terazima

Rotational diffusion coefficients of proteins along denaturation curve investigated by fluorescence anisotropy decay method

荧光各向异性衰减法研究蛋白质沿变性曲线的旋转扩散系数

• 发表时间: 2017
• 作者: 吉武智之;寺嶋正秀
• 通讯作者: 寺嶋正秀

タンパク質の構造変性と回転拡散係数

蛋白质结构变性和旋转扩散系数

• 发表时间: 2016
• 作者: 吉武智之;寺嶋正秀
• 通讯作者: 寺嶋正秀