パーキンソン病原因遺伝子産物ＰＩＮＫ１とＰａｒｋｉｎの構造基盤の確立

帕金森病致病基因产物PINK1和Parkin结构基础的建立

• 批准号: 15J10559
• 负责人: 尾勝 圭
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J10559/
• 关键词: パーキンソン病; ミトコンドリア; リン酸化; マイトファジー; Parkin; PINK1; ユビキチン; キナーゼ

PINK1とParkinはパーキンソン病の原因遺伝子産物である。細胞内では膜電位の低下した不良ミトコンドリアを分解することが報告されている。この過程でPINK1はユビキチンとParkinのユビキチン様ドメイン(UBLドメイン)をリン酸化する。近年、複数の研究グループが自己阻害型Parkinの立体構造とリン酸化ユビキチン結合型Parkinの立体構造を明らかにしている。本研究では未だに報告のないPINK1の立体構造解析に焦点を当てて制御機構や基質の選択性を明らかにするために研究を行った。初年度に不均一なリン酸化状態のPINK1から主要なリン酸化部位を同定し、均一なサンプルを得られる発現・精製系を構築した。その発現・精製系を用いることでPINK1の結晶化に成功した。X線結晶構造解析の結果、ATP非加水分解性アナログ結合型PINK1の構造が明らかとなった。PINK1のATP認識機構が明らかになると同時に、C末端側に位置するPINK1独自の構造も明らかにできた。PINK1の構造を基にして生化学的解析と細胞生物学的解析を行うことでPINK1のユビキチン認識に重要な残基を検証した。また、部位特異的架橋法によりユビキチン側のPINK1結合部位も明らかにした。PINK1のcatalytic grooveの幅は直線状の基質を認識するキナーゼより広く、立体構造を認識するキナーゼに近い特徴があった。さらにPINK1とユビキチンの相互作用面は対照的な表面電荷を有していた。これらはPINK1の基質の選択性に影響を与えていると考えられる。一方で、ミトコンドリアには脱ユビキチン化酵素USP30が存在していることが知られており、USP30がParkinによるユビキチン化の逆反応を行うことが示唆されている。USP30の構造を基にした変異体解析を培養細胞を用いて行い、主にK63鎖及びK6鎖の変化を観察した。

Pink1和Parkin是帕金森氏病的基因产品。据报道，它降解了较差的线粒体，细胞中膜电位降低。在此过程中，PINK1磷酸化泛素和帕金的泛素样结构域（UBL结构域）。近年来，几个研究小组揭示了自抑制性帕金的三维结构以及磷酸化的泛素结合帕金的三维结构。这项研究的重点是尚未报道的PINK1的结构分析，以阐明调节机制和底物的选择性。在第一年，从具有异质磷酸化状态的PINK1中鉴定出主要的磷酸化位点，并构建了表达/纯化系统以获得均匀的样品。使用表达和纯化系统，PINK1成功结晶。 X射线晶体结构分析揭示了不可用的类似物结合的pink1 ATP的结构。同时，揭示了Pink1的ATP识别机制，并且还揭示了位于C端的Pink1的独特结构。通过基于PINK1的结构进行生化和细胞生物学分析，我们验证了对识别pink1泛素识别重要的残基。此外，泛素侧的PINK1结合位点还通过位点特异性交联揭示。 PINK1的催化凹槽的宽度比线性底物识别激酶的宽度宽，并且具有与三维结构识别激酶相似的特征。此外，PINK1和泛素之间的相互作用表面具有对比度表面电荷。这些被认为会影响pink1的底物选择性。另一方面，众所周知，去泛素酶USP30存在于线粒体中，这表明USP30对Parkin的泛素化进行了反向反应。基于USP30结构的突变分析是使用培养细胞进行的，并且主要观察到K63和K6链的变化。

项目成果

Structural basis for specific cleavage of Lys6-linked polyubiquitin chains by USP30

• DOI: 10.1038/nsmb.3469
• 发表时间: 2017-09
• 期刊: Nature Structural & Molecular Biology
• 影响因子: 16.8
• 作者: Yusuke Sato;K. Okatsu;Y. Saeki;Koji Yamano;N. Matsuda;Ai Kaiho;A. Yamagata;S. Goto‐Ito;M. Ishikawa;Y. Hashimoto;Keiji Tanaka;S. Fukai

ユビキチンキナーゼPINK1のX線結晶構造解析

泛素激酶PINK1的X射线晶体结构分析

• 发表时间: 2018
• 作者: Kyoungsuk Jin;Hongmin Seo;Toru Hayashi;Mani Balamurugan; Donghyuk Jeong;Yoo Kyung Go;Jung Sug Hong;Kang Hee Cho;Hirotaka Kakizaki;Nadede Bonnet-Mercier;Min Gyu Kim;Sun Hee Kim;Ryuhei Nakamura;and Ki Tae Nam;Jin Takahashi;尾勝 圭
• 通讯作者: 尾勝 圭