Ｇタンパク質共役型受容体のＧＲＫ／アレスチンを介したシグナル伝達制御機構の解明

阐明GRK/arrestin介导的G蛋白偶联受体信号转导控制机制

基本信息

批准号：
15J12409
负责人：
白石勇太郎
金额：
$ 1.68万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

イソロイシン側鎖δ1位メチル基を選択的に1H,13C標識し、その他を2H標識したβ-アレスチン1を大腸菌発現系より調製した。1H-13C HMQCスペクトルを測定し、観測されたシグナルを変異体を利用して帰属した。rHDLに再構成したβ2ARをセンサーチップに固定化し、β-アレスチン1をアナライトとしたSPR解析により両者の親和性を決定した。その結果、βアレスチン1は、完全作動薬が結合し、かつC末端領域がリン酸化されているβ2AR変異体に対し強く結合する一方で、逆作動薬が結合している、もしくはリン酸化されていないβ2AR変異体に対しては親和性が弱いことが示された。以上の結果は、サイズ排除クロマトグラフィーによる相互作用解析の結果からも支持された。β-アレスチン1に対して、完全作動薬もしくは逆作動薬が結合したリン酸化β2ARを添加した条件で1H-13C HMQCスペクトルを測定した。その結果、完全作動薬結合状態のリン酸化β2ARを添加した条件では多くのシグナルが線幅以上の化学シフト変化を示したのに対し、逆作動薬が結合したリン酸化β2ARを添加した条件では一部のシグナルに線幅程度の化学シフト変化が観測されるのみであった。以上の結果から、β-アレスチン1が活性化型構造へと構造変化するためには、TMドメインが活性化構造をとり、かつC末端領域がリン酸化されたGPCRと結合することが必要であることが示唆された。また、特に顕著な化学シフト変化を示した残基はNドメインとCドメインの境界面に分布していたことから、活性化に伴う構造変化は、両ドメインの相対配置の変化を伴うものであることが示唆された。

β-arrestin 1，其中在异亮氨酸侧链Δ1位置上的甲基选择性标记为1H，13C，而其他甲基则标记为2H，而β-arrestin 1是从大肠杆菌表达系统中制备的。测量1H-13C HMQC光谱，并使用突变体分配观察到的信号。将RHDL重构的β2AR固定在传感器芯片上，两者之间的亲和力通过使用β-arrestin 1作为分析物来确定SPR分析。结果表明，β-arrestin 1与具有完全激动剂结合和C末端区域磷酸化的β2AR突变体强烈结合，而对β2AR突变体的亲和力较弱，具有逆激动剂构成或未磷酸化的β2AR突变体。通过尺寸排除色谱法进行了相互作用分析的结果，上述结果也得到了支持。在与磷酸化的β2AR添加与完整或反激动剂结合的条件下测量1H-13C HMQC光谱。结果，尽管许多信号在完全由激动剂结合的状态中添加了磷酸化的β2AR的条件下显示了线宽度的化学位移变化，而在某些信号中仅观察到了在某些信号中观察到线idth的化学变化的变化，但在某些信号中观察到了磷酸化的β2AR。以上结果表明，为了使β-arrestin 1变成活化的结构，TM结构域必须采用活化的结构和C末端区域与磷酸化的GPCR结合。此外，在N和C结构域之间的界面上分布了表现出特别显着的化学位移变化的残基，这表明与激活相关的结构变化伴随着两个域相对排列的变化。

项目成果

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Elucidation of the CCR1- and CCR5-binding modes of MIP-1α by application of an NMR spectra reconstruction method to the transferred cross-saturation experiments.

DOI：
10.1007/s10858-015-9992-x
发表时间：
2015-12
期刊：
Journal of biomolecular NMR
影响因子：
2.7
作者：
Yoshiura C;Ueda T;Kofuku Y;Matsumoto M;Okude J;Kondo K;Shiraishi Y;Shimada I
通讯作者：
Shimada I

NMR analyses of the phosphorylation of β2-adrenergic receptor using segmental isotopic labeling

使用分段同位素标记对 β2-肾上腺素受体磷酸化进行 NMR 分析

DOI：
发表时间：
2015
期刊：
影响因子：
0
作者：
Yutaro Shiraishi;Yutaka Kofuku;Takumi Ueda;Mei Natsume;Hideo Iwai;Ichio Shimada
通讯作者：
Ichio Shimada

Identification of a Conformational Equilibrium That Determines the Efficacy and Functional Selectivity of the μ-Opioid Receptor.

DOI：
10.1002/anie.201508794
发表时间：
2015-12-21
期刊：
Angewandte Chemie (International ed. in English)
影响因子：
0
作者：
Okude J;Ueda T;Kofuku Y;Sato M;Nobuyama N;Kondo K;Shiraishi Y;Mizumura T;Onishi K;Natsume M;Maeda M;Tsujishita H;Kuranaga T;Inoue M;Shimada I
通讯作者：
Shimada I

Identification of a Conformational Equilibrium That Determines the Efficacy and Functional Selectivity of the mu-Opioid Receptor

确定 mu-阿片受体的功效和功能选择性的构象平衡的鉴定

DOI：
发表时间：
2017
期刊：
影响因子：
0
作者：
Yutaro Shiraishi;Junya Okude;Takumi Ueda;Yutaka Kofuku;Motohiko Sato;Naoyuki Nobuyama;Keita Kondo;Takuya Mizumura;Kento Onishi;Mei Natsume;Masahiro Maeda;Hideki Tsujishita;Takefumi Kuranaga;Masayuki Inoue;Ichio Shimada
通讯作者：
Ichio Shimada

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