核磁気共鳴法を用いたGタンパク質共役型受容体によるアレスチン活性化機構の解明

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完全作動薬であるformoterolが結合したβ2ARを調製し、GRK2によるリン酸化反応を行ったうえで、そのリン酸化部位をC tailを観測対象としたNMR測定により同定した。SPR法によりβ2ARとβ-アレスチン1の親和性を解析し、非リン酸化β2ARはβ-アレスチン1との結合が検出されない一方で、リン酸化β2ARではKd = 0.2 μMで結合することを示した。さらに、リン酸化β2ARに逆作動薬であるcarazololを結合させた際には、その親和性がKd > 1 μMに低下することを示した。以上の結果から、β2ARのC tailはリン酸化依存的に、TM coreは活性化依存的にβアレスチンと結合すること、特にリン酸化が見かけの親和性に大きく寄与していることが分かった。また、β-アレスチン1の構造変化をNMRシグナルの化学シフト変化を指標に解析しところ、formoterol結合型リン酸化β2ARの結合に伴い、β-アレスチン1のN,C lobe1の界面に特に大きな化学シフト変化が検出され、2つのローブの相対配置の変化を伴う構造変化が示唆された。一方で、carazolol結合型リン酸化β2ARが結合した際には、遊離状態に対応する化学シフト、folmoterol結合型リン酸化β2AR結合状態に対応する化学シフトの両方にシグナルが観測された。以上の結果から、β2ARの活性化したTM coreとの結合が、β-アレスチン1の構造変化に大きく寄与していることが分かった。さらに、β-アレスチン1の構造解析に用いられている構造認識抗体Fab30の結合がβ-アレスチン1の構造に与える影響を解析し、Fab30が結合すると、β2AR TM coreとの結合がない状態でも、β-アレスチン1が活性化構造を安定に形成することが分かった。