アミノ酸一次配列に基づいた小胞体膜フリッパーゼの新規同定法の確立

基于氨基酸一级序列的内质网膜翻转酶鉴定新方法的建立

• 批准号: 16J00095
• 负责人: 中尾 裕之
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J00095/
• 关键词: フリップフロップ; 蛍光分光法; フリッパーゼ; スクランブラーゼ; 膜貫通ペプチド; 小胞体膜

本研究は、膜貫通領域に共通の物理化学的性質を持つ“タンパク質群”が、小胞体膜のフリップフロップを促進しているという仮説を実証し、小胞体膜のフリップフロップ促進機構を解明することを目的としている。今年度は、①モデルペプチドを用いて、どのような物理化学的性質がフリップフロップを顕著に促進するかをについて検討し、さらに、②ヒト細胞を用いて、EDEM1が小胞体膜フリッパーゼかを調べるための条件設定を行った。研究①では、膜貫通ヘリックス中に存在する2つの親水性アミノ酸残基（Arg、His）の位置の違いが、ペプチドのフリップフロップ促進能に与える影響について評価した。ArgとHisの間隔が1～5残基のモデル膜貫通ペプチドを、Fmoc固相合成法により作製した。蛍光分光法を用いてペプチドのフリップフロップ促進能を評価したところ、ArgとHisの間隔が3、4残基のペプチドが高い活性を示した。αヘリックスは3.6残基で1回転するため、2つの親水性アミノ酸残基が、ヘリックスの同じ面に位置することがフリップフロップ促進に重要であることが示唆された。研究②では、ヒト細胞としてHEK293細胞を用いて、ミクロソーム画分の分画、及び、ミクロソーム画分を用いたフリップフロップ測定の条件設定を行った。細胞破砕液から遠心分離法によりミクロソーム画分を分画し、ウエスタンブロットによりミクロソーム画分を精製できたことを確認した。蛍光分光法を用いてミクロソーム画分のフリップフロップを測定したところ、ラットの肝臓由来のミクロソーム画分を用いて得られたこれまでの研究と同様に、t1/2＝十数分という速いフリップフロップが見られた。

This study は, transmembrane domain に の common physical and chemical properties を hold つ "タ ン パ ク quality group" が, small cell body membrane の フ リ ッ プ フ ロ ッ プ を promote し て い る と い う 仮 said を be し, small cell body membrane の フ リ ッ プ フ ロ ッ プ promotion agencies を interpret す る こ と を purpose と し て い る. Our は ", (1) モ デ ル ペ プ チ ド を with い て, ど の よ う な physical and chemical properties of が フ リ ッ プ フ ロ ッ プ を 顕 に advancement す る か を に つ い て beg し 検, さ ら に, (2) ヒ ト cells を using い て, EDEM1 が small cell body membrane フ リ ッ パ ー ゼ か を adjustable べ る た め の conditions set line を っ た. Research (1) で は, transmembrane ヘ リ ッ ク ス に exist す る 2 つ の hydrophilic ア ミ ノ acid residues (Arg, ihs) の position の violations い が, ペ プ チ ド の フ リ ッ プ フ ロ ッ プ can promote に and え る influence に つ い て review 価 し た. ArgとHis <s:1> interintervals of が1 to 5 residues <e:1> モデ <s:1> membrane through ペプチドを, Fmoc solid-phase synthesis method によ preparation た. 蛍 light spectrometry を with い て ペ プ チ ド の フ リ ッ プ フ ロ ッ プ can promote を review 価 し た と こ ろ, Arg と ihs の が between 3, 4 residue の ペ プ チ ド が high い activity を shown し た. Alpha ヘ リ ッ ク ス は residue で 1 to 3.6 planning す る た め, 2 つ の hydrophilic ア ミ ノ acid residues が, ヘ リ ッ ク ス の with じ surface に position す る こ と が フ リ ッ プ フ ロ ッ プ promote に important で あ る こ と が in stopping さ れ た. Research (2) で は, ヒ ト cells と し て を HEK293 cells with い て, ミ ク ロ ソ ー ム points の paintings, paintings and び, ミ ク ロ ソ ー ム points を used い た フ リ ッ プ フ ロ ッ の condition in determination of プ line set を っ た. Cell 砕 breaking liquid か ら telecentric separation に よ り ミ ク ロ ソ ー ム paint points を し, ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト に よ り ミ ク ロ ソ ー ム draw points を refined で き た こ と を confirm し た. 蛍 light spectrometry を with い て ミ ク ロ ソ ー ム draw points の フ リ ッ プ フ ロ ッ プ を determination し た と こ ろ, ラ ッ ト の is crucial liver origin の ミ ク ロ ソ ー ム points を used い て must ら れ た こ れ ま で と の research with others に, t1/2 = ten points と い い う speed フ リ ッ プ フ ロ ッ プ が see ら れ た.

项目成果

Membrane-Spanning Sequences in Endoplasmic Reticulum Proteins Promote Phospholipid Flip-Flop

• DOI: 10.1016/j.bpj.2016.05.023
• 发表时间: 2016-06-21
• 期刊: BIOPHYSICAL JOURNAL
• 影响因子: 3.4
• 作者: Nakao, Hiroyuki;Ikeda, Keisuke;Nakano, Minoru
• 通讯作者: Nakano, Minoru

小胞体膜タンパク質の膜貫通配列によるリン脂質flip-flopの促進

内质网膜蛋白跨膜序列促进磷脂翻转

• 发表时间: 2016
• 作者: 吉田太地;町田洋;井澤公一;北川健太郎;島田祐樹;長澤直裕;鬼丸孝博;高畠敏郎;中尾 裕之，池田 恵介，石濱 泰，中野 実
• 通讯作者: 中尾 裕之，池田 恵介，石濱 泰，中野 実

膜貫通配列ペプチドの物理化学的性質によるリン脂質flip-flopの促進

跨膜序列肽的理化特性促进磷脂翻转

• 发表时间: 2016
• 作者: Masatoshi Mitaki;Kazuhiko Sugiyama;Yasutaka Imai;and Masao Kitano;Toshihiro Kawakatsu;野原実;中尾 裕之，池田 恵介，石濱 泰，中野 実
• 通讯作者: 中尾 裕之，池田 恵介，石濱 泰，中野 実