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進化工学と有機合成の融合による革新的蛍光プローブの開発

通过进化工程和有机合成的融合开发创新荧光探针

基本信息

批准号：
16J01710
负责人：
寺井琢也
金额：
$ 7.49万
依托单位：
Saitama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-04-22 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J01710/
关键词：
進化分子工学ペプチド化学蛍光センサー合成化学

项目摘要

前年度までに確立したcDNA display技術を活用して、引き続き蛍光修飾ペプチドライブラリを使った「標的タンパク質に結合することで発光特性が変わる蛍光プローブ」および「プロテアーゼに対する特異的発蛍光基質」の開発を行った。前者に関しては、各候補ペプチド配列の「蛍光変化」を直接検出可能なフローサイトメーター（FACS）評価系を利用した2段階セレクションシステムを立ち上げるため、ペプチドライブラリをコードするＤＮＡを酵母発現用のプラスミドに導入し、酵母表面に候補ペプチドを発現させて蛍光修飾した。続いてFACSで個別の蛍光を測定・分取することによりセレクションを行った。しかし、細胞表面の内在性タンパク質の影響が予想より大きくＳ／Ｎの良いセレクションを実施する事は出来なかった。そこでマイクロビーズ表面にＤＮＡとペプチドを修飾する新たな系を構築することを試みた。種々の条件検討の結果、２種類のモデルＤＮＡを別々のビーズ上に結合させ、夫々に対応するペプチドを当該ビーズ上に固定して分取することに成功した。また後者においては、プロテアーゼによって切断を受けたペプチド配列をセレクションするシステムの構築に前年度の研究で概ね成功している。そこで今年度は更に条件検討を進め、実際にランダムライブラリからの基質セレクションを行った。その結果、セリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼに対して効率よく酵素反応を受けるペプチド配列を濃縮し、次世代シークエンス解析によって基質配列に関する知見を得ることができた。

In the past year, it has been established that cDNA display technology has been used to develop "target protein binding,""light emitting characteristics," and "specific light emitting substrates." The former is related to the selection of candidate sites, the "light transformation" of each candidate site arrangement directly detects the possibility of using the FACS evaluation system, the introduction of DNA for yeast production, and the development of candidate sites on the yeast surface. In addition, the FACS can be used to detect and analyze the changes in the light. It is expected that the intrinsic properties of the cell surface will be affected by the large S/N ratio. A new system was constructed. The results of the study on the conditions of two species of DNA were successfully combined with the results of two species of DNA. The latter was successfully studied in the previous year. This year's review of the conditions for progress, implementation of the new process, and implementation of the new process. As a result, the gene expression and gene expression of the gene expression were reduced, and the gene expression and gene expression of the gene expression were reduced.