定量プロテオミクスを用いた血液脳関門中枢作用型タンパク質輸送機構の解明

利用定量蛋白质组学阐明血脑屏障中枢作用的蛋白质转运机制

• 批准号: 16J02046
• 负责人: 佐藤 和貴
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J02046/
• 关键词: 血液脳関門透過型タンパク質; クレアチンキナーゼ; 受容体介在型トランスサイトーシス; 定量プロテオミクス; 血液脳関門透過タンパク質; 血液脳関門; 内因性タンパク質体内動態; LC-MS/MS

本研究は、定量プロテオミクスを用いて、血液脳関門(BBB)を透過する新たなタンパク質を同定し、その輸送機構の解明および脳への高分子delivery system(DS)の構築への応用を目的としている。本年度は、本研究で同定した新たなBBB透過性タンパク質であるクレアチンキナーゼ(CK)に関して、BBBにおけるCKアイソザイム依存的な輸送活性の違いの解明と、BBBにおけるCK輸送担体の同定に取り組んだ。CKをキャリアとした脳への高分子DSを構築する上では、より輸送活性の高いCKアイソザイムを選択することが重要である。そこで、大腸菌を用いて細胞質型のCKである脳型(CK-BB)及び筋肉型(CK-MM)のリコンビナントタンパク質を合成し、ヒト脳毛細血管内皮細胞株hCMEC/D3(D3細胞)を用いてTranswell上に構築したin vitro BBBの透過性(血液から脳方向)を解析した。その結果、CK-BBおよびCK-MMの双方で、僅かに有意ではないものの4℃に比較して37℃で透過速度が増加する傾向が見られた。また血液方向からD3細胞内への内在化活性を解析したところ、CK-BBおよびCK-MMの双方で、4℃に比較して37℃で有意に内在化速度が増加した。興味深いことに、37℃におけるCK-MMの内在化速度は、CK-BBに比較し10倍以上高いことが明らかになった。本結果から、BBBにはCKの輸送機構が存在し、CK-MMにより親和性の高い機構であることが示唆された。さらに本年度はCK輸送担体の同定を目的に、マウス胎児線維芽細胞株(MEF-1)およびそのLRP-1欠損株(PEA13)を用いて、CK-MMの取込み実験を行った。その結果、PEA13ではMEF-1に比較し有意に内在化活性が低いことが明らかとなり、BBBにおけるCKの輸送の一部にLRP-1が関与する可能性が示唆された。

This research aims to identify new technologies for the use of quantitative software, the penetration of blood barrier doors (BBBs), the understanding of delivery mechanisms, and the use of advanced polymer delivery systems (DS) in the construction of polymer delivery systems (DS). This year, the same study was conducted to determine the new BBB permeability and quality of CK (CK), BBB permeability and CK (CK) dependent transport activity, and BBB permeability and CK transport carrier identification. CK is the most important component of polymer DS construction. In this study, E. coli was synthesized by cytoplasm-type CK (CK-BB) and muscle-type CK (CK-MM), and capillary endothelial cell line hCMEC/D3(D3 cells) was constructed by Transwell to analyze the permeability of BBB in vitro. As a result, CK-BB and CK-MM have a tendency to increase transmission velocity only intentionally at 4℃ compared to 37℃. The internalization activity of D3 cells in the direction of blood was analyzed. The internalization rate of CK-BB and CK-MM increased significantly at 4℃ compared with 37℃. The internalization speed of CK-MM is 10 times higher than CK-BB at 37℃The results show that BBB is the best choice for CK and CK-MM. This year, the CK-MM selection process was carried out with the aim of identifying the CK delivery vector, the embryo line germ cell line (MEF-1) and the LRP-1 deficient cell line (PEA-13). The results showed that PEA13 was lower than MEF-1 in intentional internalization activity, BBB was lower than MEF-1 in CK transport, and LRP-1 was lower than MEF-1 in intentional internalization activity.

项目成果

Discovery proteomics of blood-brain barrier permeable endogenous protein candidates

血脑屏障可渗透内源性候选蛋白的发现蛋白质组学

• 发表时间: 2017
• 作者: Yasuo Uchida;Kazuki Sato;Masanori Tachikawa;Tetsuya Terasaki
• 通讯作者: Tetsuya Terasaki

Quantitative proteomics-based characterization of apical and basolateral membrane protein localization in human retinal pigmental epithelial cells

基于定量蛋白质组学的人视网膜色素上皮细胞顶膜和基底外侧膜蛋白定位的表征

• 发表时间: 2018
• 作者: Kazuki Sato;Laura Hellinen;Masanori Tachikawa;Mika Reinisalo;Yasuo Uchida;Heidi Kidron;Arto Urtti;Tetsuya Terasaki
• 通讯作者: Tetsuya Terasaki

Role of dysfunctional Glia in Epileptogenesis

功能失调的神经胶质细胞在癫痫发生中的作用

• 发表时间: 2018
• 作者: Kazuki Sato;Julia Mueller,Yuka Kasahara;Peter Bedner;Ryuta Koyama;Christian Steinhaeuser; Masanori Tachikawa
• 通讯作者: Masanori Tachikawa

LC-MS/MS-based targeted quantification of connexin43 phosphorylation in epileptic hippocampal astrocyte

基于 LC-MS/MS 的癫痫海马星形胶质细胞连接蛋白 43 磷酸化的靶向定量

• 发表时间: 2017
• 作者: 佐藤和貴;寺崎哲也;立川正憲
• 通讯作者: 立川正憲

Selective Protein Expression Changes of Leukocyte-Migration-Associated Cluster of Differentiation Antigens at the Blood-Brain Barrier in a Lipopolysaccharide- Induced Systemic Inflammation Mouse Model without Alteration of Transporters, Receptors or Tight

脂多糖诱导的全身性炎症小鼠模型中血脑屏障处白细胞迁移相关分化抗原簇的选择性蛋白表达变化，而不改变转运蛋白、受体或紧密蛋白

• 发表时间: 2019
• 期刊: Biological and Pharmaceutical Bulletin
• 影响因子: 2
• 作者: Kazuki Sato;Masanori Tachikawa;Michitoshi Watanabe;Yasuo Uchida;Tetsuya Terasaki
• 通讯作者: Tetsuya Terasaki