ＤＮＡヘリカーゼ装着における複製開始複合体の機能構造動態とその制御の解明

阐明复制起始复合物的功能结构动力学及其在 DNA 解旋酶附着过程中的调节

• 批准号: 16J02075
• 负责人: 﨑山 友香里
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J02075/
• 关键词: oriC; DnaA; 高次複合体; DNA複製開始反応; ヘリカーゼ装着; 大腸菌; 染色体複製開始; DnaBヘリカーゼ; DiaA; 一本鎖DNA結合

本年度の前半は、大腸菌染色体の複製起点oriC上でのDnaA多量体形成から一本鎖oriC DNA結合までの分子機構に関する研究成果を筆頭論文として投稿し、その追加実験に時間を費やした(2017年9月末、論文受理)。この機構はDnaBヘリカーゼ装着の前段階である。本年度の後半に以下の課題に取り組んだ。(1)大腸菌細胞内でのDnaB-DnaA相互作用の検討：これまでの生化学的解析により、oriC上で形成されたDnaA多量体中の特定のDnaA分子が、DnaBと機能的な相互作用をもつと示唆されていた。大腸菌細胞内でも解析を行うため、DnaB-DnaA結合と競合するDiaAを欠損させた株を用いて、oriC内の特定のDnaA結合部位にDnaB結合能欠損変異DnaAを導入した。この細胞の複製開始能を解析した結果、生化学的解析結果が支持された。(2)DnaB装着時における一本鎖DNA結合の意義の解明：oriCの左側領域上に形成されるDnaAサブ多量体が一本鎖oriC DNAと結合することを見出していたが、本年度の試験管内構成系を用いた解析研究により、右側DnaAサブ複合体も一本鎖oriC DNAと結合すること、そしてこれがDnaB装着を促進することが示唆された。また、oriCの左側領域では、DnaA濃度が十分高い場合と異なり、低濃度DnaAでは、片側の一本鎖oriC DNAのみにDnaBが優先的に装着されることが示唆された。以上の結果から、oriC上で形成された各DnaAサブ複合体が、一本鎖oriC DNAと結合して一本鎖状態を安定化させることで、効率のよい両鎖へのDnaB装着が進められると考えられた。

在今年的上半年，我提交了有关DNAA多聚体形成的分子机制的研究结果，该分子机制涉及大肠杆菌染色体染色体oric复制与单链oric oric DNA的结合，并花了时间在其他实验上（于2017年9月底接受）。该机制是DNAB解旋酶安装的阶段。今年晚些时候解决了以下问题：（1）检查大肠杆菌细胞中DNAB-DNAA相互作用：先前的生化分析表明，在ORIC形成的DNAA多聚体中，特定的DNAA分子具有与DNAB的功能相互作用。为了在大肠杆菌细胞中进行分析，使用缺乏与DNAB-DNAA结合竞争的DIAA菌株将突变的DNAA缺陷DNAA引入ORIC中的特定DNAA结合位点。分析了开始复制该细胞的能力并支持生化分析结果。 (2) Elucidation of the significance of single-stranded DNA binding when DNAB is attached: We found that the DNAA sub-multimers formed on the left region of oriC bind to single-stranded oriC DNA, but this year's analysis study using in vitro structure suggested that the right-sided DNAA sub-complex also binds single-stranded oriC DNA, and that this promotes DNAB attachment.此外，与ORIC左侧的DNAA浓度足够高不同，建议在低浓度的DNAA下，DNAB优先连接到仅一侧单链oric DNA上。从上述结果中可以认为，在oric上形成的每个DNAA子复合都与单链oric DNA结合以稳定单链状态，从而使这两个链有效地附着有效地附着DNAB。

项目成果

細菌DNA複製開始複合体の近原子構造モデルと機能解析

细菌DNA复制起始复合物的近原子结构模型及功能分析

• 发表时间: 2016
• 作者: 清水将裕;野口泰徳;﨑山友香里;川上広宣;片山勉;高田彰二
• 通讯作者: 高田彰二

Near-atomic structural model for bacterial DNA replication initiation complex and its functional insights

• DOI: 10.1073/pnas.1609649113
• 发表时间: 2016-12-13
• 期刊: PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA
• 影响因子: 11.1
• 作者: Shimizu, Masahiro;Noguchi, Yasunori;Takada, Shoji
• 通讯作者: Takada, Shoji

Structure, mechanism and regulation of Escherichia coli replication initiation complexes in DNA unwinding

大肠杆菌DNA解旋复制起始复合物的结构、机制和调控

• 发表时间: 2016
• 作者: Tsutomu Katayama;Yukari Sakiyama;Yasunori Noguchi;and Hironori Kawakami
• 通讯作者: and Hironori Kawakami

大腸菌の複製開始複合体における二重鎖DNA開裂とヘリカーゼ相互作用の分子機構

大肠杆菌复制起始复合物中双链 DNA 切割和解旋酶相互作用的分子机制

• 发表时间: 2016
• 作者: 片山 勉;崎山 友香里;赤間 勇介;野口 泰徳;川上 広宣;加生 和寿
• 通讯作者: 加生 和寿

大腸菌のoriCにおける複製開始とその制御のため複製開始因子DnaAタンパク質が構築する高次複合体の分子機構

大肠杆菌oriC复制起始因子DnaA蛋白构建的高阶复合物复制起始及其控制的分子机制

• 发表时间: 2016
• 作者: 片山 勉;加生 和寿;﨑山 友香里;赤間 勇介;井上 祐希江;酒井 隆至;杉山 諒;川上 広宣
• 通讯作者: 川上 広宣