Establishment of transgenic methods for functional analysis on cathepsin of Fasciola

本研究は第１にFasciola 属において遺伝子組換え技術を確立すること、第２に確立した遺伝子組換え技術を用い、カテプシン等の病原性分子の機能解析を行うことを目的とした。まず、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法の検討を行った。レポーターアッセイの結果、レポーター遺伝子の導入は確認できなかった。次に、エレクトロポレーション法を用い、Fasciola sp.の幼虫に対し、蛍光色素で標識をしたレポーター遺伝子のmRNAを曝露した。蛍光顕微鏡を用いて蛍光標識したmRNAを観察したところ、微弱ではあったが、幼虫の体内に蛍光シグナルを確認でき、体内にｍRNAを導入することができたと考えられた。しかしながら、レポーターアッセイの結果、mRNA曝露に伴う発色強度の増加は認められなかったことから、エレクトロポレーションによるmRNAの導入は、その導入効率および翻訳効率が不十分であることが示唆された。次に、dsRNAを用いたカテプシンL1遺伝子の発現抑制を試みた。幼虫にカテプシンL1に対するdsRNAを曝露した結果、カテプシンL1遺伝子の発現抑制は認められなかった。そこで、カテプシンに代わる病原性分子として、タンパク質Aを標的とした。幼虫にタンパク質Aに対するdsRNAを曝露した結果、タンパク質Aの発現抑制が確認された。次に、マウス腸管ループ試験を行い、腸管外へ脱出した幼虫の割合を比較した結果、曝露群と非曝露群の間に差は認められなかった。このことから、タンパク質Aは幼虫の腸管脱出には関与しない可能性が示唆された。次に、マウスを用いた肝臓移行試験を行った結果、曝露群では肝臓における肝蛭遺伝子のコピー数が減少する傾向がみられた。このことからタンパク質Aは肝臓への侵入時または肝実質内の移動時に働くことが示唆された。

本研究は第１にFasciola 属において遺伝子組換え技術を確立すること、第２に確立した遺伝子組換え技術を用い、カテプシン等の病原性分子の機能解析を行うことを目的とした。まず、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法の検討を行った。レポーターアッセイの結果、レポーター遺伝子の導入は確認できなかった。次に、エレクトロポレーション法を用い、Fasciola sp.の幼虫に対し、蛍光色素で標識をしたレポーター遺伝子のmRNAを曝露した。蛍光顕微鏡を用いて蛍光標識したmRNAを観察したところ、微弱ではあったが、幼虫の体内に蛍光シグナルを確認でき、体内にｍRNAを導入することができたと考えられた。しかしながら、レポーターアッセイの結果、mRNA曝露に伴う発色強度の増加は認められなかったことから、エレクトロポレーションによるmRNAの導入は、その導入効率および翻訳効率が不十分であることが示唆された。次に、dsRNAを用いたカテプシンL1遺伝子の発現抑制を試みた。幼虫にカテプシンL1に対するdsRNAを曝露した結果、カテプシンL1遺伝子の発現抑制は認められなかった。そこで、カテプシンに代わる病原性分子として、タンパク質Aを標的とした。幼虫にタンパク質Aに対するdsRNAを曝露した結果、タンパク質Aの発現抑制が確認された。次に、マウス腸管ループ試験を行い、腸管外へ脱出した幼虫の割合を比較した結果、曝露群と非曝露群の間に差は認められなかった。このことから、タンパク質Aは幼虫の腸管脱出には関与しない可能性が示唆された。次に、マウスを用いた肝臓移行試験を行った結果、曝露群では肝臓における肝蛭遺伝子のコピー数が減少する傾向がみられた。このことからタンパク質Aは肝臓への侵入時または肝実質内の移動時に働くことが示唆された。