「生まれ」の時期の違いを利用する遺伝子導入法を用いた線条体区画構造の神経活動解析

利用出生时间差异的基因转移方法对纹状体区室结构进行神经活动分析

• 批准号: 16J02501
• 负责人: 奥宮 太郎
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J02501/
• 关键词: 線条体; patch; matrix; Dlx1; Dlx5; 顕微内視鏡; パッチ; マトリックス; カルシウムイメージング

1）「生まれ」すなわち発生時期の違いを利用して，線条体パッチ区画およびマトリックス区画選択的な遺伝子導入法を開発した．まずパッチ区画の標識のため，Dlx5-CreERT2アレルとR26-CAG-LoxP-mTFP1アレルをもつダブルヘテロマウスを作成した．胎齢12日目に4-OHTを投与することにより，早生まれのパッチ区画選択的にmTFP1蛍光タンパク質を発現させた．次にマトリックス区画の標識のため，Dlx1-CreERT2アレルとR26-CAG-LoxP-mTFP1アレルをもつダブルヘテロマウスを作成した．胎齢15日目にtamoxifenを投与することにより，遅生まれのマトリックス区画選択的にmTFP1を発現させた．成体の組織切片を用いて標識の区画選択性を確認した．2）上記遺伝子導入方法を用いて，区画選択的なカルシウムイメージングを行う実験系を構築した．まずDlx5-CreERT2マウスと，Cre組換え依存的にGCaMP3を発現するAi38マウスを交配し，4-OHT投与により早生まれ神経細胞へのGCaMP3導入を試みた．しかし，GCaMP3アレルの組み換え効率がR26-CAG-LoxP-mTFP1アレルに比べかなり低く，内視鏡下の観察は困難であった．そこで，区画選択的にmTFP1を発現させたマウスに，アデノ随伴性ウイルスベクターを用いて赤色カルシウム感受性蛍光タンパク質RCaMPを区画非選択的に発現させた．作成したマウス線条体に光ファイバーを用いた顕微内視鏡を埋め込んだ結果，自由行動下のマウスで，mTFP1で標識された線条体区画領域を内視鏡視野内に緑色で確認し，RCaMPの輝度変化を赤色で観察できることがわかった．学習課題中の神経活動を記録することはできなかったが，本研究の核心である自由行動下における線条体区画選択的なカルシウムイメージングが技術的に可能であることを示した．

1) Development of the method of introducing genes into the selected regions of the line-shaped body during the development period. Dlx5-CreERT2-R26-CAG-LoxP-mTFP1-R26-R26-R26- The 4-OHT was cast on the 12th day of the pregnancy and the mTFP1 was produced early in the pregnancy. Dlx1-CreERT2-R26-CAG-LoxP-mTFP1-R26-R26-R26- On the 15th day of the month, tamoxifen was cast and mTFP1 was produced. 2) The method of gene introduction was used to construct a system for the selection of tissue sections from adults. Dlx5-CreERT2 is a Cre group dependent protein that can be expressed as GCaMP3. Dlx 5-CreERT 2 is a Cre group dependent protein that can be expressed as GCaMP3. GCaMP3 has a lower efficiency than R26-CAG-LoxP-mTFP1, which is difficult to detect under endoscope. In this case, the mTFP1 of the selected region is displayed in the selected region, and the sensitivity of the selected region is displayed in the selected region. Make a line of light, use it, micro endoscope, bury it, move it freely, mTFP1, mark it, line of body drawing field, green, confirm it, RCaMP brightness change, red, check it. The core of this study is to record the mental activities of the subjects and to show the possibilities of the techniques.