遺伝性疾患の治療薬となりうる化合物の探索とその化合物の分子機構の解析

点击翻译按钮获取中文摘要

本研究ではナンセンス変異に起因する遺伝性疾患の治療薬となりうる化合物の同定を目的とし、RlucとFlucの間にイントロンを含む配列を挿入してNMD標的となるように設計したRluc-X-HBB-Flucレポーター発現系を用いてNMD阻害剤とリードスルー剤の探索を行い、8種のNMD阻害剤候補化合物を得た。１）NMD 阻害剤候補化合物の検証、２）リードスルー剤探索用レポーターの改良、３）スクリーニング過程で発見したジストロフィン遺伝子内の新規IRES活性についての検証実験を行った。１）NMD 阻害剤候補化合物の検証：東京大学創薬機構のコアライブラリーと既存薬ライブラリーに含まれる、同定された化合物と共通の構造を持つ化合物 108種についてアッセイを行った。２）リードスルー剤の探索用レポーターの改良：以下の問題点が明らかとなった。①PTC124処理によりFlucタンパク質の安定化が観察された。②ナンセンス変異周辺の配列がIRES活性を持つため、リードスルー効率を正しく評価できていない。①に関しては、アッセイ系の改善を行った。Rlucの配列中にstopコドンを挿入し、Nano lucと連結させたレポーターRluc(stop)-HBB-Nlucを構築した。Nano luc活性を検出することにより高感度にリードスルーを観察することが可能になった。②に関しては、IRESを含む領域を削除したレポーターを構築することで正確にリードスルー効率を測定することが可能となった。３）ジストロフィン遺伝子内の新規IRES活性の検証：スクリーニングに用いたRluc-X-HBB-Flucレポーター由来の産物をウエスタンにより解析した結果、Fluc相当C末端側断片が観察された。RlucとFlucの間にジストロフィン遺伝子の配列の一部を挿入し、IRESの最小領域を同定するためのレポーターを構築した。