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新規パッケージング細胞を用いた次世代型アデノウイルスベクターの効率的な作製

使用新型包装细胞高效生产下一代腺病毒载体

基本信息

批准号：
16J05920
负责人：
若林圭作
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-04-22 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J05920/
关键词：
Adベクター VA-RNA shRNA Dicer miRNA CUL4A

项目摘要

アデノウイルス (Ad) のゲノムDNAより転写される約160塩基の小分子RNAであるVirus-associated RNA（VA-RNA）は、自然免疫を活性化することが報告されている。Adベクター投与時に活性化する自然免疫は肝障害等の副作用の引き金になると考えられているが、研究代表者らはAdベクターからもVA-RNA が発現することを報告しており、故にVA-RNA欠損Adベクター（AdΔVRベクター）では、自然免疫応答が減弱し安全性が向上すると期待された。しかしながら、AdΔVRベクターの作製法は確立されていない。本研究では、Adベクター作製用のパッケージング細胞であるHEK293細胞において、マイクロRNA（miRNA）の産生に関与する分子であるDicerをノックダウンするとAdΔVRベクターが増殖することを明らかとしていたが、本細胞を用いても高タイターのAdΔVRベクターは作製できなかった。そこで、AdΔVRベクターの増殖を底上げするために、VA-RNAの生理機能の解析を試みた。過去の研究で、VA-RNAが細胞内でmiRNA様の分子（mivaRNA）に変換されることが報告されていたことから、mivaRNAに着目し検討を行ったところ、数種類あるmivaRNAアイソフォームのうち、特定のアイソフォームがAdの増殖を促進することを見出した。また、マイクロアレイ解析やin silico 解析によって、Adの増殖に寄与するmivaRNA標的遺伝子としてCUL4Aを同定した。さらに、CUL4Aがタンパク質のユビキチン化を介した分解に関与する分子であることから、CUL4A依存的に分解されるタンパク質の中でAdの増殖に関与するものを探索したところ、c-JunがAdの増殖に寄与することを明らかとした。以上、本研究により次世代型Adの開発に応用可能な新しい知見を得ることに成功した。

アデノウイルス (Ad) のゲノムDNA より転WRITE されるabout 160塩baseのsmall molecule RNA であるVirus-associated RNA (VA-RNA) and natural immunity activation report. Activation of natural immunity during administration, side effects such as liver damage, activating natural immunity, and side effects such as liver damage, activating the gold になると卡えられているが, research representative らはAdベクターからもVA-RNAが発现することをreport しており、 therefore にVA-RNA Lack Adベクター（AdΔ VRベクター）では, natural immune response is weakened, safety is improved, and expectations are raised. The manufacturing method of しかしながら and AdΔVRベクターの is established. In this study, Advocate used HEK293 cells from Adidas The relationship between the production of cellular RNA and microRNA (miRNA) and the molecular structure of microRNA Dic erをノックダウンするとAdΔVRベクターが嗗综合することを明らかとしていたが、This cell is made of いても高タイターのAdΔVRベクターは.そこで, AdΔVR ベクターの multiply を下上げするために, VA-RNA のphysiological function のANALYSIS をtest みた. Previous research, VA-RNA, intracellular microRNA 様のmolecules (mivaRNA), exchange of reports, mivaRNA目し検问を行ったところ、Several species あるmivaRNAアイソフォームのうち、Specific のアイソフォームがAdの multiply をpromote することを见出した.また、マイクロアレイanalytic やin silico ANALYZED によって、Adの Increase the reproduction and するmivaRNA target legacy 伝子としてCUL4Aを同定した.さらに、CUL4A がタンパク性のユビキチン化を Introduction したdegradation に关 and するmolecule であることから、CUL4A depends on the にdegradation されるタンパク中の中でAdの Increase and colonization and するものをExploration したところ, c-Jun がAd の嗗 multiply に Send and することを明らかとした. As mentioned above, this research shows that the next-generation type of Ad can be used successfully without any new knowledge.