出血性ではなく逆に血栓性素因となる凝固因子異常症の分子病態解析とその検出法の開発

非出血性但引起血栓易感性的凝血因子异常的分子病理学分析及检测方法的开发

• 批准号: 16J08029
• 负责人: 高木 夕希
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J08029/
• 关键词: アンチトロンビン抵抗性; 静脈血栓症; トロンボモジュリン抵抗性

原因不明の静脈血栓症発症要因究明と個々に最適な抗血栓薬選択を目指し、凝固因子異常症の分子病態解析と検出法開発を目的とした。平成29年度は活性化凝固第X因子(FXa)の不活化動態解析法の開発を中心に研究した。精製ヒト凝固第X因子(FX)を検体とし、FXaのアンチトロンビン抵抗性解析法を設定した。FXのアクチベーターにはリコンビナント活性化凝固第VII因子と組織因子の混液を使用し、FX活性化に指摘な各因子の濃度と活性化時間を決定した。十分に活性化されたFXaの不活化動態の観察に最適なヒト精製アンチトロンビンの添加濃度を決定した。残存したFXaの検出には発色性合成基質S-2222を用いた。平成28年度に樹立した野生型／各変異型FX発現ベクターを培養細胞に導入後、薬剤耐性およびウエスタンブロッティング解析による選択を行い野生型／変異型FX安定過剰発現細胞を樹立した。野生型／変異型FX安定過剰発現細胞の培養上清を限外濾過にて濃縮後、ELISA法にてFX抗原量を測定したものを組換え型野生型／変異型FXとした。最適化したFXaのアンチトロンビン抵抗性解析法にて、組換え型野生型／変異型FXのアンチトロンビン感受性を評価した。FX Arg372ミスセンス変異体は372Pro変異体を除いて予想通りアンチトロンビン抵抗性を示した。アンチトロンビン抵抗性を示すFX Arg372ミスセンス変異体の活性体は、野生型FXaよりも凝固活性を長時間持続させるために血栓症の原因となりうると推測された。また、アンチトロンビン抵抗性の程度は、遺伝子変異により置換したアミノ酸の位置だけでなく、置換したアミノ酸の性質にも依存することが示唆された。この結果は現在原因不明の静脈血栓症患者の中にFXのアンチトロンビン抵抗性患者が潜在している可能性を示唆するものである。

The causes of unexplained venous thrombosis should be investigated to determine と 々に the most suitable な antithrombotic drug selection 択を the target of <s:1> coagulation factor disorder <s:1> molecular pathological analysis と検 the method of development を the target of と た た. In the year Heisei 29, the <s:1> activation coagulation factor X (FXa) <s:1> inactivation dynamic analytical method <e:1> was launched at the を center for に research on <s:1> た. Refined ヒト solidified factor X (FX)を検 body と を検, FXa <s:1> ア チトロ チトロ ビ ビ ビ <s:1> resistance analysis method を set た た. FX の ア ク チ ベ ー タ ー に は リ コ ン ビ ナ ン ト activeness coagulation factor VII と tissue factor の し, FX activity of the utilization of mixed liquid を に blame な each factor の concentration と activeness time を decided し た. Very に activeness さ れ た FXa の inactive dynamic の 観 examine に optimum な ヒ ト refined ア ン チ ト ロ ン ビ ン の を decided to add concentration し た. The remaining たFXa 検 検 is used to produce the に chromogenic synthetic matrix S-2222を with た た. Pp.47-53 28 year に set し た wild type / - each different FX 発 now ベ ク タ ー を culture cell に after import, 薬 tonic patience お よ び ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ parsing に よ る sentaku を line い wild type / - different FX stable turning 発 cell を now set し た. Wild type / - different FX stable turning 発 の is cell culture supernatant を limit outside filtration に て after enrichment, ELISA method に て を FX antigen quantity determination し た も の を group in え type wild type / - alien FX と し た. Optimization し た FXa の ア ン チ ト ロ ン ビ ン resistance analytic method に て type, group in え wild type / - alien FX の ア ン チ ト ロ ン ビ ン susceptibility を review 価 し た. FX Arg372 ミ ス セ ン ス - variant は 372 pro - variant を except い て to think り ア ン チ ト ロ ン ビ ン resistance を shown し た. ア ン チ ト ロ ン ビ ン resistance を す in FX Arg372 ミ ス セ ン ス - variant の active body は, wild type FXa よ り も coagulation activity を long hold 続 さ せ る た め に thrombosis の reason と な り う る と speculation さ れ た. ま た, ア ン チ ト ロ ン ビ ン resistance は の, heritage 伝 sub - different に よ り replacement し た ア ミ ノ acid の position だ け で な く, replacement し た ア ミ ノ acid の nature に も dependent す る こ と が in stopping さ れ た. こ の result は now unknown cause の に in patients with venous thrombosis の FX の ア ン チ ト ロ ン ビ ン resistance in patients with potential し が て い を る possibility in stopping す る も の で あ る.

项目成果

プロトロンビンArg596ミスセンス変異がトロンビンのトロンボモジュリン結合能に及ぼす影響

凝血酶原Arg596错义突变对凝血酶血栓调节蛋白结合能力的影响

• 发表时间: 2016
• 作者: 高木夕希;鈴木幸子;河村奈美;槇山愛弓;橋本恵梨華;坂根寛人;藤岡亮也;田村彰吾;高木明;小嶋哲人
• 通讯作者: 小嶋哲人

Missense mutations in the gene encoding prothrombin corresponding to Arg596 cause antithrombin resistance and thrombomodulin resistance

• DOI: 10.1160/th16-03-0223
• 发表时间: 2016-09
• 期刊: Thrombosis and Haemostasis
• 影响因子: 6.7
• 作者: Y. Takagi;M. Murata;Toshihiro Kozuka;Y. Nakata;Ryo Hasebe;S. Tamura;A. Takagi;T. Matsushita;H. Saito;T. Kojima

Prothrombin missense mutations at 596Arg reduced the affinity of mutant thrombin to thrombomodulin controlled by Na+ concentration.

596Arg 处的凝血酶原错义突变降低了突变凝血酶与受 Na 浓度控制的血栓调节蛋白的亲和力。

• 发表时间: 2016
• 作者: Takagi Y;Kawamura N;Makiyama A;Hashimoto E;Tamura S;Takagi A;Kojima T.
• 通讯作者: Kojima T.