出血性ではなく逆に血栓性素因となる凝固因子異常症の分子病態解析とその検出法の開発

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原因不明の静脈血栓症発症要因究明と個々に最適な抗血栓薬選択を目指し、凝固因子異常症の分子病態解析と検出法開発を目的とした。平成29年度は活性化凝固第X因子(FXa)の不活化動態解析法の開発を中心に研究した。精製ヒト凝固第X因子(FX)を検体とし、FXaのアンチトロンビン抵抗性解析法を設定した。FXのアクチベーターにはリコンビナント活性化凝固第VII因子と組織因子の混液を使用し、FX活性化に指摘な各因子の濃度と活性化時間を決定した。十分に活性化されたFXaの不活化動態の観察に最適なヒト精製アンチトロンビンの添加濃度を決定した。残存したFXaの検出には発色性合成基質S-2222を用いた。平成28年度に樹立した野生型／各変異型FX発現ベクターを培養細胞に導入後、薬剤耐性およびウエスタンブロッティング解析による選択を行い野生型／変異型FX安定過剰発現細胞を樹立した。野生型／変異型FX安定過剰発現細胞の培養上清を限外濾過にて濃縮後、ELISA法にてFX抗原量を測定したものを組換え型野生型／変異型FXとした。最適化したFXaのアンチトロンビン抵抗性解析法にて、組換え型野生型／変異型FXのアンチトロンビン感受性を評価した。FX Arg372ミスセンス変異体は372Pro変異体を除いて予想通りアンチトロンビン抵抗性を示した。アンチトロンビン抵抗性を示すFX Arg372ミスセンス変異体の活性体は、野生型FXaよりも凝固活性を長時間持続させるために血栓症の原因となりうると推測された。また、アンチトロンビン抵抗性の程度は、遺伝子変異により置換したアミノ酸の位置だけでなく、置換したアミノ酸の性質にも依存することが示唆された。この結果は現在原因不明の静脈血栓症患者の中にFXのアンチトロンビン抵抗性患者が潜在している可能性を示唆するものである。