酵素の工業利用のためにＡＴＰ依存性のリン酸化酵素をピロリン酸依存性に改良する方法

将ATP依赖性磷酸化酶改进为焦磷酸依赖性工业酶的方法

• 批准号: 16J08482
• 负责人: 永田 隆平
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J08482/
• 关键词: X線結晶構造解析; キナーゼ; ピロリン酸; タンパク質工学

リン酸化酵素は、リン酸基の転移反応を触媒するが、ほとんどの場合ATPからリン酸基を受け取る。酵素は穏やかな条件で目的産物を純度良くつくるので工業的にも利用されるものの、リン酸化酵素ではATPにかかる費用がその利用の妨げになる。本研究では、より安価な化合物であるピロリン酸を利用する新規リン酸化酵素の立体構造に基づいて、ピロリン酸を利用する酵素をたくさん得ることを目指した。平成29年度は、前年度に得たピロリン酸依存性イノシトールリン酸化酵素（PPi-IK）の構造情報に基づいて、ATP依存性酵素のピロリン酸依存性への改良と、ゲノムデータベースにおける新たなピロリン酸依存性酵素の探索を行った。酵素改良については、いくつかの類似酵素に対してPPi-IKのピロリン酸認識に特徴的な残基を導入したり、PPi-IKと類似酵素とのキメラ酵素を作製するなどして、新たなピロリン酸依存性酵素の作製を試みたが、目的の活性を示す酵素は得られていない。一方、酵素改良の代わりに、ゲノムマイニングを利用することで新たなピロリン酸依存性酵素を見出すことに成功した。PPi-IKのピロリン酸認識に特徴的な残基を指標にして、ゲノムデータベースから新規のピロリン酸依存性酵素を探索した。その結果、特徴的な残基をもつピロリン酸依存性酵素の候補が、50個見つかった。いくつかの候補を大腸菌で発現させて活性を確認したところ、実際にピロリン酸を選択的に利用してリン酸化反応を行うことが分かった。さらに、その生成物はPPi-IKと異なっていた。今回の結果から、PPi-IKに特徴的な残基を目印にすることで、ゲノムデータベースから様々な基質をピロリン酸依存的にリン酸化する酵素が次々に見つかると期待できる。これまでに得られた成果を論文にまとめ、Nature Communications誌にオンライン掲載された。

The acid enzyme is a catalyst for the transformation of the acid group into ATP. Enzymes are required to produce the desired product with high purity, and are used in industrial applications. Enzymes are required to produce ATP at high cost. The present study provides a new method for the development of enzymes for the treatment of hepatitis B. In 2009, we obtained the structural information of the enzyme PPi-IK, and improved the structure of the enzyme PPi-IK. The enzyme is improved by introducing residues characteristic of PPi-IK and its analogues into the enzyme system, and by testing the enzyme system for the acid-dependent enzyme system, and by demonstrating the activity of the target enzyme. A new type of enzyme was successfully developed. PPi-IK is an indicator of the recognition of residues characteristic of PPi-IK, and a new indicator of PPi-IK acid-dependent enzymes is explored. Results, characteristic residues, candidate for acid-dependent enzymes, 50 entries In the case of E. coli, the activity of E. coli was confirmed, and in the case of E. coli, the activity of E. coli was confirmed. The product is PPi-IK. The results of this study are as follows: 1. PPi-IK characteristic residues are printed on the substrate, 2. Ppi-IK characteristic residues are printed on the substrate, 3. Ppi-IK characteristic residues are printed on the substrate, 4. Ppi-IK characteristic residues are printed on the substrate, 3. This article is published in Nature Communications.

项目成果

ピロリン酸依存性酵素の基質認識機構

焦磷酸依赖性酶的底物识别机制

• 发表时间: 2017
• 作者: 永田隆平;藤橋雅宏;佐藤喬章;跡見晴幸;三木邦夫
• 通讯作者: 三木邦夫

ピロリン酸依存性リン酸化酵素の基質認識機構の解明

焦磷酸依赖性激酶底物识别机制的阐明

• 发表时间: 2017
• 作者: 永田隆平;藤橋雅宏;佐藤喬章;跡見晴幸;三木邦夫
• 通讯作者: 三木邦夫

Crystal Structure and Reaction Mechanism of a Novel Free Serine Kinase from Thermococcus kodakarensis

柯达热球菌新型游离丝氨酸激酶的晶体结构和反应机制

• 发表时间: 2016
• 作者: 永田隆平;藤橋雅宏;牧野勇樹;川村弘樹;佐藤喬章;跡見晴幸;三木邦夫
• 通讯作者: 三木邦夫

Structural Study on the Reaction Mechanism of a Free Serine Kinase Involved in Cysteine Biosynthesis

半胱氨酸生物合成中游离丝氨酸激酶反应机制的结构研究

• DOI: 10.1021/acschembio.7b00064
• 发表时间: 2017
• 期刊: ACS Chemical Biology
• 影响因子: 4
• 作者: Ryuhei Nagata;Masahiro Fujihashi;Hiroki Kawamura;Takaaki Sato;Takayuki Fujita;Haruyuki Atomi;Kunio Miki
• 通讯作者: Kunio Miki

Crystal structure of a novel pyrophosphate-dependent kinase

新型焦磷酸依赖性激酶的晶体结构

• 发表时间: 2016
• 作者: 永田隆平;藤橋雅宏;佐藤喬章;跡見晴幸;三木邦夫
• 通讯作者: 三木邦夫