分裂酵母のＥｃｌ１ファミリータンパク質による寿命延長メカニズムの解明

阐明裂殖酵母中 Ecl1 家族蛋白的寿命延长机制

• 批准号: 16J11675
• 负责人: 島崎 嵩史
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J11675/
• 关键词: 分裂酵母; 経時寿命; Ecl1ファミリー遺伝子; タンパク質相互作用; 亜鉛結合タンパク質; 亜鉛枯渇

本研究では細胞の寿命制御・老化メカニズムを理解することを目的に、分裂酵母の寿命延長因子であるEcl1ファミリー遺伝子の解析を行った。Ecl1ファミリー遺伝子（ecl1+、ecl2+、ecl3+）は当研究室で発見された遺伝子であり、分裂酵母の細胞内に高発現することで細胞の経時寿命が延長する。しかしながら、Ecl1ファミリー遺伝子の具体的な寿命延長メカニズムやタンパク質の機能は不明であり、これらを明らかにするために以下の観点から解析を行った。まず、Ecl1ファミリータンパク質の機能を明らかにするために、Ecl1タンパク質と相互作用する因子の同定を目指した。相互作用因子の同定には、ある一定量以上のEcl1タンパク質の精製が不可欠であるが、当初は、① Ecl1タンパク質は分裂酵母の細胞内において発現量が少ないこと、② Ecl1タンパク質は精製の過程で不溶化し、精製が困難であることの2点が解析の大きな障害となっていた。この問題を解決するために、まずEcl1の発現プロモーターとしてnmt1プロモーターを導入し、分裂酵母の細胞内にEcl1タンパク質を多量に発現させた。さらに不溶化しやすいEcl1タンパク質の精製に適したTagを探索したところ、Ecl1タンパク質のC末端にGST-Tagを融合した、Ecl1-GSTタンパク質が比較的安定的に精製可能であることを見出した。結果、これらの工夫によって分裂酵母の細胞内から十分量のEcl1タンパク質を精製することに成功した。Ecl1タンパク質と共精製されるタンパク質を質量分析によって解析した結果、数百にのぼるタンパク質が検出された。現在、これらの検出された因子の欠損変異株にEcl1を高発現し寿命測定を行うことで、どの因子がEcl1タンパク質の機能に重要であるかの絞り込みを行っている。

在这项研究中，我们分析了ECL1家族基因是裂变酵母中的寿命扩展因子，目的是了解细胞寿命调节和衰老的机制。 ECL1家族基因（ECL1+，ECL2+，ECL3+）是在我们的实验室中发现的基因，而裂变酵母细胞中的高表达会随着时间的推移延伸细胞的寿命。但是，ECL1家族基因的特定机制和蛋白质的功能尚不清楚，并从以下角度进行了分析以阐明这些方法。首先，我们旨在确定与ECL1蛋白相互作用的因素，以阐明ECL1家族蛋白的功能。超过一定量的ECL1蛋白的纯化对于鉴定相互作用的因素至关重要，但最初，分析的两个主要障碍是：1）ECL1蛋白的表达水平在裂变酵母细胞中较低，而2）ECL1蛋白在纯化过程中被脱离了裂解，使其难以净化。为了解决这个问题，首先将NMT1启动子作为ECL1的表达启动子引入，并且在裂变酵母细胞中表达了大量ECL1蛋白。此外，当我们搜索适合纯化ECL1蛋白的TAG（容易被不可限化）时，我们发现ECL1-GST蛋白与ECL1蛋白的C-末端融合的ECL1-GST蛋白可以相对稳定地纯化。结果，已经采取了这些努力，以成功地从裂变酵母细胞内成功净化足够数量的ECL1蛋白。通过质谱法分析了与ECL1蛋白相关的蛋白质，并检测到数百种蛋白质。目前，通过对这些检测因素的突变体高度表达ECL1和测量寿命，我们正在缩小哪些因素对于ECL1蛋白的功能很重要。

项目成果

Ecl1 is a zinc binding protein that is involved in the zinc-limitation dependent extension of chronological lifespan in fission yeast.

Ecl1 是一种锌结合蛋白，参与裂殖酵母中锌限制依赖性延长时间寿命。

• DOI: 10.1007/s00438-016-1285-x
• 发表时间: 2017
• 期刊: Molecular Genetics and Genomics
• 影响因子: 3.1
• 作者: Takafumi Shimasaki;Hokuto Ohtsuka;Chikako Naito;Takeshi Tenno;Hidekazu Hiroaki;Hiroshi Murakami;Hirofumi Aiba
• 通讯作者: Hirofumi Aiba