Improvement of freezing tolerance of wheat by development of new strategy for transgene-free genome editing

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フルクタン分解酵素遺伝子Wfh-sm3に対して切断を行うgRNAを5カ所（T1-T5）デザインした．このうち，T1については約2000個の茎頂を調整し，CRISPR/Cas9 RNPの撃ち込みを行った．第5葉CAPS解析の結果，7個体で変異と考えられる非切断バンドを検出した．T5では，600個の茎頂に対して撃ち込みを行い，5葉におけるCAPS解析の結果，2個体で変異が検出された．T2に対しては約3200個の茎頂を調整したが，変異が検出されず，T4も200処理個体中，変異検出は0個体であった，更に，in vitro Cas9切断活性を調べたところ２個体で変異が確定した．これらの非切断バンドを配列解析したところ，2塩基欠失と2塩基置換が検出された．FEH1に対して１カ所(T1)のgRNAをデザインした．フルクタン分解酵素遺伝子FEH1の変異体の作出については，600個体を処理し，このうち１個体で第５葉におけるCAPS解析でポジティブなシグナルを与えた．両遺伝子の合計で，冬コムギを用いて5000個以上の茎頂にボンバードメントを行った．春コムギに比べて茎頂組織が小さく取り扱いがしにくい上，種子のカビ汚染の問題があったため，全体的な変異体の獲得は低調だった． Whf-sm3については2個の変異系統，FEH1については1個体の候補系統が得られた点は評価できるが，それらの変異体がフルクタンの蓄積や耐凍性の向上をもたらすかについては，期限内に解析できなかった．