Improvement of freezing tolerance of wheat by development of new strategy for transgene-free genome editing

通过开发非转基因基因组编辑新策略提高小麦的耐冻性

• 批准号: 17F17747
• 负责人: 今井 亮三
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: National Agriculture and Food Research Organization
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-11-10 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17F17747/
• 关键词: 低温馴化; コムギ; 耐凍性; 越冬性; フルクタン; ゲノム編集

フルクタン分解酵素遺伝子Wfh-sm3に対して切断を行うgRNAを5カ所（T1-T5）デザインした．このうち，T1については約2000個の茎頂を調整し，CRISPR/Cas9 RNPの撃ち込みを行った．第5葉CAPS解析の結果，7個体で変異と考えられる非切断バンドを検出した．T5では，600個の茎頂に対して撃ち込みを行い，5葉におけるCAPS解析の結果，2個体で変異が検出された．T2に対しては約3200個の茎頂を調整したが，変異が検出されず，T4も200処理個体中，変異検出は0個体であった，更に，in vitro Cas9切断活性を調べたところ２個体で変異が確定した．これらの非切断バンドを配列解析したところ，2塩基欠失と2塩基置換が検出された．FEH1に対して１カ所(T1)のgRNAをデザインした．フルクタン分解酵素遺伝子FEH1の変異体の作出については，600個体を処理し，このうち１個体で第５葉におけるCAPS解析でポジティブなシグナルを与えた．両遺伝子の合計で，冬コムギを用いて5000個以上の茎頂にボンバードメントを行った．春コムギに比べて茎頂組織が小さく取り扱いがしにくい上，種子のカビ汚染の問題があったため，全体的な変異体の獲得は低調だった． Whf-sm3については2個の変異系統，FEH1については1個体の候補系統が得られた点は評価できるが，それらの変異体がフルクタンの蓄積や耐凍性の向上をもたらすかについては，期限内に解析できなかった．

The enzyme sequence Wfh-sm3 is the sequence of gRNA sequences T1-T5. CRISPR/Cas9 RNP is about 2000 stem tops. The CAPS analysis results of the fifth leaf showed that 7 individuals were different from each other. T5: 600 individuals were different from each other. T2: 3200 individuals were different from each other. T4: 200 individuals were different from each other. In vitro Cas9 cut off the activity of. For example, if the gene is not cut off, the gene will be analyzed and the gene will be replaced by the gene. FEH1 gene will be analyzed. 600 individuals were processed, and CAPS analysis was performed on the 5th leaf of FEH1. In total, there are more than 5000 top-of-the-tree trees in use. The top of the stem is small and the seed is polluted. Whf-sm3 contains two different systems, FEH1 contains two different systems,