Fluoreszenzlebensdauer-Manipulation in den autofluoreszierenden Proteinen: Entwicklungsstrategie für neue Anwendungen

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Dieses Projekt behandelt das Design autofluoreszierender Proteine, deren Fluoreszenzlebensdauer gezielt durch Mutagenese modifiziert wird. Der erste Teil beinhaltet die de-novo Entwicklung eines Fluoreszenzindikators für das Lifetime-Imaging (FLIM) zum Ziel. Es soll ein redoxsensitives Grün Fluoreszierendes Protein (GFP) etabliert werden, das das Redoxpotenzial eines markierten Organismus über die Fluoreszenzlebensdauer auszulesen gestattet. Die Reduktion einer Disulfid-Brücke im Proteingerüst zu einer Dithiolfunktion erhöht die lokale Flexibilität des Chromophors und begünstigt damit strahlungslose Kanäle aus dem angeregten Zustand. Die gemittelte Fluoreszenzlebensdauer ist so ein Maß für das Verhältnis von reduziertem zu oxidiertem Protein. Im zweiten Teil soll ein Markerprotein, welches für die räumlich hochauflösende STED-Mikroskopie verwendet werden kann, am Ende der Entwicklung stehen. Hier wird ein Blau Fluoreszierendes Protein (BFP) mit optimierten Eigenschaften entwickelt, wobei sich die Verbesserung auf eine Verlängerung der Fluoreszenzlebensdauer, eine gesteigerte Photostabilität und die An- und Abregbarkeit mit vergleichsweise billigen, gepulsten Diodenlasern beziehen. Der Erfolg im Laufe der Proteinentwicklung wird jeweils an einem eigens dafür gebauten Experiment überprüft. Durch diese Rückkopplung wird eine effiziente Entwicklung der Proteine gewährleistet. Getestet wird die Apparatur mit dem Gold Fluoreszierenden Protein (GdFP), das für beide Applikationen geeignet erscheint.