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ヒト一倍体細胞を用いたオルガネラ膜間接着因子の探索と機能解析

利用人单倍体细胞寻找细胞器膜间粘附因子并进行功能分析

基本信息

批准号：
17J07322
负责人：
田代晋也
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Yamagata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J07322/
关键词：
オルガネラ間コンタクトミトコンドリア ER 小胞体 GFP

项目摘要

本研究の目的は哺乳類細胞においてミトコンドリア・ER間コンタクトを制御する因子を，遺伝学的スクリーニングにより同定することである。三年目の目標は，二年目でスクリーニングを行って同定したミトコンドリア・ER膜間コンタクトを制御する因子候補について、機能検証することである。本年度では、スクリーニングにより同定されたオルガネラ膜間でのsplit GFPの再構成を阻害する遺伝子について一過性発現による局在解析とsiRNAを用いた機能解析を行った。同定されていた遺伝子の中でも過去にコンタクトサイトへの寄与が報告されていない遺伝子について、まずミトコンドリアの形態への影響を調べた。siRNAによって発現を抑制した結果、これらの遺伝子のうちいくつかについてはミトコンドリアのチューブの長さを伸長させ、細胞内での分布などの形態に影響を与えた。これはER-ミトコンドリア間コンタクトがミトコンドリアの切断に関与することを考慮すると妥当な結果であると考えられた。またERは細胞内でのカルシウムの貯蔵庫としての役割を果たしており、ER-ミトコンドリア間コンタクトはミトコンドリア内のカルシウム濃度の調節に大きな影響を与えていると考えられている。そこで今回同定されたER-ミトコンドリア間を調節する候補因子のsiRNAによる発現抑制のカルシウムシグナリングへの影響を、ミトコンドリア内カルシウム濃度を蛍光強度によって可視化するタンパク質を用いて定量した。さらにこれら因子にFLAGもしくはGFPタグなどを付加したタンパク質を細胞内で過剰発現させ、抗体を用いた免疫染色法などで局在を検証した。これらの実験によりミトコンドリア・ER両オルガネラコンタクト部位に局在し，ミトコンドリア形態などに影響を与えた因子について相互作用相手を免疫沈降法などで探索している。

The purpose of this study is to determine whether mammalian cells are responsible for the regulation of ER factors, which are the same as those of mammals. The target is listed for three years, and the target for the second year is the same as that for ER. In addition, it is necessary to monitor the monitoring factors, such as monitoring, monitoring, and monitoring factors. This year, we are responsible for determining that the split GFP in the film is reorganized into a blocking effect. The results show that the bureau is using the siRNA machine to analyze the bank. In the same way, you can send a report in the same way that you want to send it to the report. The results of siRNA were significantly suppressed, and the distribution of intracellular enzymes in the cells was affected by the growth of the cells. Please tell me that the ER- is correct and that the results are in good order. In the ER, there was an increase in the size of the cell, and the results were cut. The ER- was used to cut the fruit, and the ER- was used to measure the temperature in the cell. This time, we use the same method to determine the value of ER-. This time, we use the candidate factor, siRNA, to suppress the influence of light intensity on the intensity of light. The FLAG was detected by immunostaining, and the antibody was detected by immunostaining. The antibody was detected by immunostaining method. The location of the ER is located, and the shape is different. The interaction between the factor and the factor is related to the immunoprecipitation method.