4D Imaging-based Analysis of Segregation Errors of individually labeled Chromosomes in Mouse Oocytes

基于 4D 成像的小鼠卵母细胞中单独标记染色体的分离错误分析

• 批准号: 18J01017
• 负责人: 竹之内 修
• 金额: $ 2.33万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J01017/
• 关键词: chromosome; CRISPR; machine learning; meiosis; oocyte; dCas; labeling; chromosome segregation; 染色体; 染色体分配; 卵母細胞; イメージング; 老化; 微小管; 紡錘体; 減数分裂; DNA標識; ライブイメージング; 光遺伝学; 分子プローブ

【CRISPR-Sirius構成タンパク質の精製】細胞内のCRISPR-Sirius構築タンパク質の存在量を安定させるため、厳密に管理された濃度の市販精製dCasを卵母細胞に打ち込んだ。結果、各染色体の標識効率が大きく改善された。次に、Hisタグカラムを用いて、複合タンパク質（sgRNA結合タンパク質と蛍光タンパク質）を大腸菌から精製し、卵母細胞へと導入した。結果、減数分裂の途中で染色体の一部が断片化してしまうことが判明した。精製の際に除去しきれなかった大腸菌由来の成分が、卵母細胞内の染色体のIntegrityに影響を与えていると考えられる。今後、精製タグを変更して再挑戦する。【染色体分配に影響を与えないイメージング条件の最適化】本研究では、3色の蛍光を同時に検出し、解析を行う。しかし、撮影条件は2色イメージングに最適化されている。3色イメージングを行う場合、励起光による卵母細胞へのダメージが懸念されたため、顕微鏡撮影の条件を最適化した。まず、全てのタイムポイント（3分おき）で、3色の蛍光タンパク質を励起・検出した結果、4割の卵母細胞が減数分裂を途中で停止してしまった（cond.1）。そこで、動態追跡に用いる1色（青）のみを3分おきに、染色体同定に用いる2色（赤と近赤）を30分おきに検出するように撮影条件を変更した。さらに、励起光を可能な限り減弱して撮影を行ったところ、イメージングによる減数分裂の停止を防ぐことができた（cond.2）。この条件において、8%の卵母細胞は減数分裂を途中で停止したが、イメージングを行わずにdish上で培養した場合においても1－2割程度の卵母細胞は減数分裂を途中で停止することが知られているため、イメージングによる影響ではないと考えられる。以上により、cond.2が3色イメージングに最適な実験条件であることを明らかにした。

The CRISPR - Sirius constitute タ ン パ ク qualitative の refined 】 intracellular の CRISPR - Sirius build タ ン パ ク qualitative の を stability and the presence of さ せ る た め, 厳 に management さ れ た concentration の city selling refined dCas を oocytes に play ち 込 ん だ. The results showed that the <s:1> labeling efficiency of each chromosome was が greatly improved by く く and された. に, ihs タ グ カ ラ ム を with い て, composite タ ン パ ク mass (sgRNA combining タ ン パ ク qualitative と 蛍 light タ ン パ ク qualitative) を coliform か ら refined し, oocyte へ と import し た. As a result, during meiosis <s:1>, a part of the で chromosome <e:1> is が fragmented, て, まう, とが, and とが are identified, indicating た. Refined の interstate に remove し き れ な か っ た coliform origin の composition が, の within the oocyte chromosome の Integrity に influence を and え て い る と exam え ら れ る. In the future, the refined タグを will change to て and then challenge する. 【 distribution of chromosomes and に influence を え な い イ メ ー ジ ン の グ conditions optimization 】 this study で は, 3 color の 蛍 を light at the same time に 検 し, parsing う を line. <s:1> されて <s:1>, pinching conditions ジ 2 color <s:1> メ ジ ジ グに グに optimization されて る る. Line 3 color イ メ ー ジ ン グ を う occasions, excitation light に よ る oocytes へ の ダ メ ー ジ が suspense さ れ た た め, 顕 micromirror pinch of shadow を の conditions optimization し た. ま ず, whole て の タ イ ム ポ イ ン ト (3 お き) で, 3 color の 蛍 light タ ン パ ク qualitative を wound up · 検 out し た results, 4 cut の oocytes が meiosis を で stop on the way し て し ま っ た (cond. 1). そ こ で, dynamic tracing に with い る 1 color (green) の み を 3 お き に, chromosome with fixed に い る 2 color (red と near red) を 30 お き に 検 out す る よ う を に pinch of shadow conditions - more し た. さ ら に, excitation light を may な limits り abate し て pinch of shadow line を っ た と こ ろ, イ メ ー ジ ン グ に よ る meiosis の stop を ぐ こ と が で き た (cond. 2). こ の conditions に お い て, 8% の oocytes は meiosis を で stop on the way し た が, イ メ ー ジ ン グ を line わ ず に nurturing で dish し た occasions に お い て も 1-2 degree of cut の oocytes は meiosis を で stop on the way す る こ と が know ら れ て い る た め, イ メ ー ジ ン グ に よ る influence で は な い と exam え ら れ る. The above に よ り, cond. 2 が 3 color イ メ ー ジ ン グ に optimum な be 験 conditions で あ る こ と を Ming ら か に し た.