ＴＲＦ２を介したＯＲＣリクルートによるテロメア維持機構の特異的変異体を用いた解析

H30年度までにORCとの結合のみを欠損したTRF2 (E111A/E112A)変異体（以下、TRF2 (EE)変異体）を同定し、HeLa細胞の遺伝子編集により内在性TRF2とTRF2 (EE)変異体を置換したTRF2 (EE)株および比較対象のTRF2 (WT)株を樹立した。さらに、TRF2 (EE)株ではTRF2 (WT)株と比べ、テロメア結合ORC量が少ないことや複製ストレス存在下におけるテロメア含有微小核の数が多いことを明らかにし、TRF2-ORC結合がテロメアへのORC結合や複製ストレス存在下でのテロメア恒常性維持に重要であることを示した。R1年度の実績を以下に述べる。テロメアORC結合阻害がテロメアの複製ストレス感受性に影響するかどうかを更に明らかにするため、複製ストレス下における樹立株でのテロメア損傷度（DNA損傷応答因子53BP1と共局在するテロメアfociを10個以上含む細胞の割合として定義）を評価した。その結果、TRF2 (EE)株では0.1 mMヒドロキシウレア処理による弱い複製ストレスの誘導によりテロメア損傷度が増加した一方、TRF2 (WT)株では変化しなかった。前述の結果と同様この結果も、テロメアORC結合が複製ストレス下におけるテロメアの維持に重要であることを示唆している。ORCの代表的な機能は、MCM複合体を染色体に装着し、DNA複製開始点を形成することである。そこで、TRF2-ORC結合を介したテロメア維持機構を調べるため、テロメア結合MCM量の解析をChIP-qPCR法などにより進めた。その結果、TRF2 (EE)株ではテロメアへのMCM装着量が低下傾向にあることが示された。これまでの結果を総合し、TRF2-ORC結合を介して複製ストレス存在下で利用される予備のDNA複製開始点が形成されることがテロメア恒常性維持に重要であると考えている。

H30年度までにORCとの結合のみを欠損したTRF2 (E111A/E112A)変異体（以下、TRF2 (EE)変異体）を同定し、HeLa細胞の遺伝子編集により内在性TRF2とTRF2 (EE)変異体を置換したTRF2 (EE)株および比較対象のTRF2 (WT)株を樹立した。さらに、TRF2 (EE)株ではTRF2 (WT)株と比べ、テロメア結合ORC量が少ないことや複製ストレス存在下におけるテロメア含有微小核の数が多いことを明らかにし、TRF2-ORC結合がテロメアへのORC結合や複製ストレス存在下でのテロメア恒常性維持に重要であることを示した。R1年度の実績を以下に述べる。テロメアORC結合阻害がテロメアの複製ストレス感受性に影響するかどうかを更に明らかにするため、複製ストレス下における樹立株でのテロメア損傷度（DNA損傷応答因子53BP1と共局在するテロメアfociを10個以上含む細胞の割合として定義）を評価した。その結果、TRF2 (EE)株では0.1 mMヒドロキシウレア処理による弱い複製ストレスの誘導によりテロメア損傷度が増加した一方、TRF2 (WT)株では変化しなかった。前述の結果と同様この結果も、テロメアORC結合が複製ストレス下におけるテロメアの維持に重要であることを示唆している。ORCの代表的な機能は、MCM複合体を染色体に装着し、DNA複製開始点を形成することである。そこで、TRF2-ORC結合を介したテロメア維持機構を調べるため、テロメア結合MCM量の解析をChIP-qPCR法などにより進めた。その結果、TRF2 (EE)株ではテロメアへのMCM装着量が低下傾向にあることが示された。これまでの結果を総合し、TRF2-ORC結合を介して複製ストレス存在下で利用される予備のDNA複製開始点が形成されることがテロメア恒常性維持に重要であると考えている。