翻訳の不正確性制御による新規遺伝子治療法の開発

通过控制翻译不准确性开发新的基因治疗方法

• 批准号: 18J12857
• 负责人: 山下 隼
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J12857/
• 关键词: アンチセンスオリゴヌクレオチド; リードスルー治療法; リボソーム; 翻訳終結

ナンセンス変異は、アミノ酸に対応するコドンが終止コドン（PTC）に置きかわる変異で、タンパク質合成が途中で終了し機能不全のタンパク質が合成されるため、重篤な疾患につながる。そのような疾患を治療する手法としてリードスルー療法が知られている。この手法では、リボソームがPTCを翻訳する際に誤ったアミノアシルtRNAを取り込ませることで、全長タンパク質を産生させる。これまで翻訳の正確性を低下させる化合物はリードスルー治療に利用されてきた。しかし、不正確な翻訳を非特異的に誘導することによる毒性が臨床応用を制限している。本研究では、標的の終止コドン特異的なリードスルーを可能にする新規リードスルー戦略の開発を行った。我々は、真核生物の翻訳終結機構に着目した。近年報告されたcryo-EM解析によって、真核生物終結因子（eRF）は終止コドンに結合すると、mRNAをU字型コンフォメーションに変形させることが示された。 U-ternの形成はmRNAをリボソーム内トンネルに引き込む。したがって我々は、PTC下流に結合するオリゴヌクレオチドが、mRNAの引き込み、すなわち翻訳終結を阻害し、アミノアシルtRNAの取り込みを誘導すると仮定した。PTCを導入した変異ルシフェラーゼをレポーターとして、オリゴヌクレオチドの結合部位や長さを最適化したところ、配列特異的なリードスルーを誘導することに成功した。また、ウエスタンブロッティングで全長タンパク質を検出することに成功した。また、本手法は真核生物由来の無細胞翻訳系でのみ適用できたことから、仮定に基づいた機序でリードスルーが誘導されていることが示唆される。PTC特異的にリードスルーを誘導できる本手法は、難治性遺伝病に対するリードスルー療法における問題を克服することが期待される。

废话突变是突变，其中与氨基酸相对应的密码子被终止密码子（PTC）取代，该密码子（PTC）终止了中间的蛋白质合成并导致功能失调的蛋白质合成，从而导致严重的疾病。通读疗法被称为治疗此类疾病的方法。当核糖体翻译PTC时，该技术通过掺入不正确的氨基酰基tRNA来产生全长蛋白质。迄今为止，降低翻译准确性的化合物已用于读取疗法。但是，由于非特异性诱导不准确的翻译而引起的毒性限制了临床应用。在这项研究中，我们制定了一种新颖的读取策略，该策略允许终止对目标的特定于停止密码子的读取。我们专注于真核生物的翻译终止机制。最近报道的冷冻EM分析表明，真核终止因子（ERF）将mRNA转化为与停止密码子结合后的U形构象。 U-terns的形成将mRNA吸引到肌瘤内隧道中。因此，我们假设PTC下游的寡核苷酸抑制mRNA提取，IE翻译终止和诱导氨基酰基TRNA摄取。我们使用PTC引入的突变荧光素酶作为记者，我们优化了寡核苷酸的结合位点和长度，并成功地诱导了序列特异性的读取。此外，通过蛋白质印迹成功地检测全长蛋白是成功的。此外，由于该方法只能应用于来自真核生物的无细胞翻译系统，因此表明读取是由假设机制诱导的。这种方法可以在PTC中特别诱导铅铅，预计将克服铅直接治疗难治性遗传疾病的问题。