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クロロフィルのＭｇを脱離する酵素ＳＧＲの触媒機構と生理的役割の解明

阐明从叶绿素中解吸镁的酶 SGR 的催化机制和生理作用

基本信息

批准号：
18J20898
负责人：
小畑大地
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度はクロロフィル分解系の最初の反応を触媒するクロロフィル：Mg脱離酵素SGRの触媒機構の解明に引き続き取り組んだ。SGRのMg脱離反応（有機分子から金属原子を脱離する反応）はほとんど報告がない珍しい反応であるため、その触媒機構を解明することはタンパク質科学・酵素科学的に重要な知見となる。本研究では、アミノ酸置換体の作成により触媒機構の提案を目指した。クロロフィルからのMg脱離は酸性条件下で進行するため、SGRの触媒には酸性アミノ酸残基によるH+供与が関与すると仮説を立て、候補残基の置換体を作成した。しかし、SGRの発現量が少ないために、置換体の活性が得られず、機能の特定ができずにいた。この問題は大腸菌タンパク質発現系の改良により、従来の1000倍量のSGRを合成する系を開発したことで解決された。これにより、これまで活性を検出できなかった置換体についても置換の影響を評価できるようになった。その結果、SGRのMg脱離反応に関与する酸性アミノ酸残基を3つまで絞り込めた。さらに、大量発現に加えてSGRの高純度な精製法を確立したことで、基質のクロロフィルとSGRの結合を分光学的に解析できるようになった。現在、3つの残基それぞれの置換が基質との結合にどのように影響を及ぼすか測定し、活性部位の同定と触媒を担う酸性アミノ酸残基の特定を行っている。また、高純度かつ大量のSGRが調製可能になったため、SGRの持つSTAY-GREENドメインのX線結晶構造解析も視野に入ってきた。このドメインは既知のタンパク質構造のいずれとも似ていない新規の構造である。STAY-GREENドメインの構造決定はタンパク質科学として大きな意義があるとともに、そのドメインが触媒するMg脱離反応についてもより詳細なメカニズム解明の可能性を秘めている。今ではSGRの結晶が得られており、結晶の品質を改善中である。

This year, the initial reaction catalyst of Mg-free enzyme SGR was analyzed. SGR Mg dissociation reaction (organic molecule, metal atom, dissociation reaction) is reported as an important insight into the nature science and enzyme science. This study is aimed at the preparation of acid displacer and the proposal of catalyst mechanism. The separation of Mg from SGR is carried out under acidic conditions, and the catalyst of SGR is prepared under acidic conditions, such as H+ supply and substitution of candidate residues. The amount of SGR produced is small, the activity of the substituent is small, and the specific function is small. This problem is solved by improving the quality of Escherichia coli and synthesizing SGR in 1000 times. The effect of substitution on activity is evaluated. As a result, SGR is free from acid residues and acid residues. The high purity purification method of SGR was established in the presence of a large amount of SGR, and the binding of SGR to the matrix was analyzed. Now, the substitution of 3 residues, the binding of matrix, the influence of reaction, the determination of active site, the determination of catalyst, the determination of acid residues. High purity, large amount of SGR modulation possible, SGR maintenance STAY-GREEN, X-ray crystal structure analysis, field of view. This is a new type of structure. The structural determination of STAY-GREEN is based on qualitative science and the significance of Mg separation and catalyst. SGR crystallization is now in progress, and the quality of crystallization is improving.