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Establishment of secretory synthesis method for sulfated peptides and its application to quantitative analysis of tyrosylprotein sulfation

硫酸化肽分泌合成方法的建立及其在酪氨酰蛋白硫酸化定量分析中的应用

基本信息

批准号：
21K19091
负责人：
黒木勝久
金额：
$ 4.16万
依托单位：
University of Miyazaki
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K19091/
关键词：
チロシン硫酸化大腸菌ブレビバチルス LC-MS

项目摘要

翻訳後修飾の一つチロシン硫酸化の機能解析手段として重要な硫酸化ペプチドの新たな合成法の確立を目指し、本年度はブレビバチルスおよび大腸菌を用いたTPSTと基質の同時発現系の作成および硫酸化ペプチドのLC-MSを用いた条件検討を行った。当初の計画通り、ブレビバチルス菌体内での硫酸化ペプチド合成を目指し、ブレビバチルス菌体内発現用プラスミド(pNI/pNI-His)を用いた酵素の発現と精製に成功したが、酵素活性を得ることが出来なかった。次に、分泌発現用ベクターであるpNCMO2やpNY326でも発現させたが、活性型を得ることが出来なかった。そのため、次に活性型の酵素を得られる大腸菌(Origami)内での共発現系(pETDuet)の作製を行った。現在、基質ペプチドと酵素の発現解析を行っている。次に、硫酸化ペプチドの質量分析を用いた分析条件の検討をコレシストケニン硫酸体(CCK-S)を用いて行った。その結果、LC-MS(QTrap5500)を用いた検出に成功した。さらに、将来的なMRM法を用いた定量解析に求められる最適なtransitionを選択するために必要な溶媒と検出モードの最適化に成功した。そこで、昨年度に硫酸化を見出した新型コロナの受容体ACEIIのペプチドを大腸菌で発現精製し、酵素的に硫酸化反応を行い、ペプチドの脱塩処理を行ったのちに、最適化した条件下で、LC-MSにより分析を行い、検出に成功することが出来た。MRM法を用いた定量解析法の条件を見出すことが出来たことから、今後の翻訳後修飾の硫酸化の定量解析につながる萌芽的な結果が得られたと考えている。

A functional analysis method for sulfation of a modified TPT substrate and a new synthesis method for sulfation of a modified TPT substrate were established. This year, the preparation of a simultaneous production system for sulfation of a modified TPT substrate and a new LC-MS were discussed. In this paper, the sulfated protein synthesis and enzyme activity in bacteria were studied. The enzyme production and purification of sulfated protein (pNI/pNI-His) in bacteria were successfully performed. The secondary, secretory, and active forms of pNCMO2 and pNY326 are produced. The production of pETDuet in Escherichia coli was studied. Now, substrate selection and enzyme production analysis are performed. Secondly, a discussion of the analytical conditions for the quality analysis of sulfated pigments was carried out using the Coresitonen Sulfate (CCK-S). LC-MS(QTrap5500) was successfully detected in the middle of the test. The MRM method was successfully applied to quantitative analysis of the optimal transition and optimization of the necessary solvent. In the past year, a new type of sulfation receptor ACEII was discovered, and the production and purification of E. coli, enzyme sulfation reaction, purification and purification were carried out under optimized conditions. LC-MS analysis was carried out and successfully detected. The MRM method was used in quantitative analysis of the conditions found, and the results of quantitative analysis of sulfation after modification were obtained.