Establishment of secretory synthesis method for sulfated peptides and its application to quantitative analysis of tyrosylprotein sulfation

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翻訳後修飾の一つチロシン硫酸化の機能解析手段として重要な硫酸化ペプチドの新たな合成法の確立を目指し、本年度はブレビバチルスおよび大腸菌を用いたTPSTと基質の同時発現系の作成および硫酸化ペプチドのLC-MSを用いた条件検討を行った。当初の計画通り、ブレビバチルス菌体内での硫酸化ペプチド合成を目指し、ブレビバチルス菌体内発現用プラスミド(pNI/pNI-His)を用いた酵素の発現と精製に成功したが、酵素活性を得ることが出来なかった。次に、分泌発現用ベクターであるpNCMO2やpNY326でも発現させたが、活性型を得ることが出来なかった。そのため、次に活性型の酵素を得られる大腸菌(Origami)内での共発現系(pETDuet)の作製を行った。現在、基質ペプチドと酵素の発現解析を行っている。次に、硫酸化ペプチドの質量分析を用いた分析条件の検討をコレシストケニン硫酸体(CCK-S)を用いて行った。その結果、LC-MS(QTrap5500)を用いた検出に成功した。さらに、将来的なMRM法を用いた定量解析に求められる最適なtransitionを選択するために必要な溶媒と検出モードの最適化に成功した。そこで、昨年度に硫酸化を見出した新型コロナの受容体ACEIIのペプチドを大腸菌で発現精製し、酵素的に硫酸化反応を行い、ペプチドの脱塩処理を行ったのちに、最適化した条件下で、LC-MSにより分析を行い、検出に成功することが出来た。MRM法を用いた定量解析法の条件を見出すことが出来たことから、今後の翻訳後修飾の硫酸化の定量解析につながる萌芽的な結果が得られたと考えている。