权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

イオンチャネル2次元密度と1分子活性：膜タンパク制御の新基軸展開に向けて

二维离子通道密度和单分子活性：迈向膜蛋白调节的新轴

基本信息

批准号：
21K19212
负责人：
岩本真幸
金额：
$ 4.08万
依托单位：
University of Fukui
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K19212/
关键词：
チャネル脂質2重膜集散電気生理蛍光離合集散

项目摘要

本研究では膜タンパク質の細胞膜上での離合集散と活性の関係を解明することを目標とし、それに向け、独自の人工細胞膜実験技術・CBB法を応用し、①膜タンパク質2次元密度制御の基盤実験技術の確立と、②イオンチャネルを使った実証実験を行う。これまでに、蛍光標識した膜タンパク質・KcsAカリウムイオンチャネルを人工細胞膜に組込み、全反射蛍光(TIRF)観察にてKcsAに由来する多数の輝点を膜上に観察することができている。そこで、これら輝点が１個のチャネル分子に由来するものなのか、あるいは複数のチャネル分子が集合しているものなのか、輝点の蛍光消光ステップ数により判別を試みた。この実験に際し、励起光強度と撮影時間、そして撮影した映像から各輝点の消光ステップ数をカウントする方法について検討を行い、最適な実験手順を確立させた。興味深いことに、予備実験ではKcsAチャネルには膜上に単分子で存在している状態と、複数分子が集合している状態があることが示唆された。さらに、各状態の確率は溶液のpHや膜脂質組成によって変化する可能性を示す結果が得られた。溶液のpHはKcsAチャネルの活性化因子であり、また、酸性pHで活性化したKcsAは膜脂質組成によって活性修飾を受けることが明らかになっている。よって今回得られた結果は、集合状態と活性の関係を反映している可能性があり、今後より詳細な検討を行う必要がある。一方、当初の研究計画遂行に必要な、2次元密度のみに関与する不活性なKcsA変異体の作製については難航しており、適切な変異導入部位の発見にはまだ至っていない。

In this study, the relationship between the separation, distribution and activity on the membrane of the membrane was studied. The purpose of this study was to investigate the application of the CBB method to the artificial membrane technology. The establishment of the substrate technology for the two-dimensional density control of the membrane was carried out. This is because most of the bright spots on artificial cell membranes are detected by TIRF (Total Reflective Fluorescence). The number of light extinction points in a cluster of molecules is determined. The method for determining the extinction time of each bright spot and the optimum operation sequence is as follows: In the case of a single molecule, the state in which a plurality of molecules are assembled is the state in which they exist. The accuracy of each condition is shown by the possibility of changing the pH and lipid composition of the solution. The pH of the solution is the activation factor of KcsA, and the pH of the solution is the activation factor of KcsA membrane lipid composition. The result of the survey is that the state of aggregation and the relationship between activity are likely to be discussed in detail in the future For one thing, it is necessary to carry out the original research project. For the second dimensional density, it is necessary to carry out the research project. For the second dimensional density, it is necessary to carry out the research project.