腱・靭帯における力学的適応の分子メカニズムの解明

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ブタ腱由来の酸可溶性Ⅰ型コラーゲン溶液からコラーゲンゲルや原線維を再構成させ，この過程で起こるコラーゲン分子間の力学的相互作用を水晶振動子マイクロバランス（QCM）を用いて解析し，再構成された原線維の微細構造観察と引張試験を行った．さらに，コラーゲンとプロテオグリカン（コンドロイチン硫酸C）を反応させて線維束を再構成させ，コラーゲン分子とプロテオグリカンの力学的相互作用について検討した．水晶振動子を装着したセルのカップ部に，マイクロピペットを用いてコラーゲン溶液を滴下した．次に，コンドロイチン硫酸C，再構成用緩衝液を滴下して，コラーゲンゲルを再構成させた．得られた周波数の変化から，最小サセプタンス周波数と損失係数を算出した．その結果，コラーゲンにコンドロイチン硫酸を加えて反応させると，コラーゲンのみで反応させた場合に比べて，再構成されたゲルの弾性が大きくなることが明らかになった．前年度より幅広くpHを変化させてコラーゲン溶液から原線維を再構成させ，この原線維の引張試験を行った．試験は倒立顕微鏡のステージ上で，暗視野下で行った．ステージ上に固定したマイクロマニピュレータに取り付けたマイクロ針を用いて，原線維を取り上げ，その両端をマイクロ針に巻きつけた．その後，生理食塩水中で原線維が破断するまでマイクロ針を移動させた．その結果，引張強度と接線弾性係数は，pH8.8で最も大きくなり，pHが8.8より小さくなると小さくなった．また，pHが8.8よりも大きくなると引張強度と接線弾性係数は大幅に小さくなった．蛍光標識（FITC）Ⅰ型コラーゲン溶液と再構成用緩衝液を用いてコラーゲン原線維を再構成させ，その再構成過程を蛍光顕微鏡を用いて観察した．その結果，溶液中の分子が一度マイクロフィブリルやサブフィブリルを形成し，その後原線維を形成することが明らかになった．