一細胞CRISPRスクリーニング法を駆使した機能的GWAS-SNP検出法の確立

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2022年度は、SNPスクリーニングの実施のために、ガイドRNA (gRNA)レンチウイルスライブラリーとCRISPRレポータ細胞の作製に取り掛かった。まず、複数のガイドRNAを同時に発現可能なgRNA発現ライブラリーの検討を行った。次に挙げる理由から、Cas9システムだけでなくCas12システムも検討した。Cas9システムでは、CRISPR活性を発揮するためにはtracrRNAと crRNAの２種類のRNAが必要であるのに対して、Cas12システムでは5crRNAのみで機能を発揮するため、より単純なベクター構成が可能である。Cas12システムでは複数のgRNAを並列に配置することが可能なため、複数エンハンサー・SNP活性の同時制御が可能であると考えた。スクリーニング用のバーコードが検出可能なように、複数のgRNA配列と同時にバーコード配列が転写されるシステムを採用した。骨芽細胞の分化に関わる転写因子群を制御する複数のエンハンサーに対してgRNAを設計し、その機能を確認した。次に、間葉系幹細胞の骨芽細胞分化を蛍光タンパク質でモニタリング可能な細胞株の樹立に着手した。まず、間葉系幹細胞を株化するため、ヒトTERT1遺伝子をレンチウイルスで感染させたのち、薬剤耐性遺伝子を用いたセレクションを行い、間葉系幹細胞株を得た。次に、骨芽細胞分化マーカーの転写制御領域と蛍光タンパク質をコードする融合遺伝子をゲノムにノックインする実験に着手した。Cas9システムを用いて、融合遺伝子をヒトゲノムのセーフハーバー領域にノックインした。現在、薬剤セレクション・シングルセルクローニングを進めている。