ヘビ毒成分LAAOによる酸化脂質依存的細胞死の誘導機構に関する研究

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本研究の目的は、ヘビ毒成分であるLAAOが酸化脂質依存的細胞死を誘導することを実証し、その発現機構を明らかにすること、及び毒ヘビ咬傷におけるLAAOの寄与を明らかにしLAAO阻害剤の治療薬への可能性を検討することである。本年度は以下の2点について培養細胞を用いた解析を行い、LAAOが酸化脂質依存的細胞死を誘導することの検証および阻害活性を持つ化合物のスクリーニングを行った。(1) LAAOによる酸化脂質依存的細胞死誘導の検討実験にはヒト横紋筋肉腫由来RD細胞株を用い、LAAOは市販で入手可能なニシダイヤガラガラヘビ(Crotalus atrox)由来のLAAOを用いた。細胞障害性の評価はMTTアッセイおよびLDHアッセイにより評価した。その結果、LAAOの濃度依存的な細胞死誘導が確認された。この細胞死は過酸化水素の消去酵素であるカタラーゼの添加により抑制された。そこで各種細胞死経路の阻害剤を用いてLAAOによる細胞死がどのタイプの細胞死かを検討した。その結果、アポトーシス経路の阻害剤z-VAD、ネクロトーシス経路の阻害剤ネクロスタチン-1では顕著な抑制効果は認められなかった。一方、フェロトーシスの抑制剤であるフェロスタチン-1および鉄キレーターであるデフェロキサミン 、フェナントロリンで有意に抑制された。また細胞内の酸化脂質の生成を、酸化脂質特異的蛍光プローブであるLiperfluoを用いて観察した結果、LAAO処理により細胞内の酸化脂質量が増加した。この増加はフェロスタチン-1、DFO処理により抑制された。以上の結果より、ヘビ毒成分であるLAAOによる細胞死は、酸化脂質依存的なフェロトーシスであることが示された。(2) LAAOによる細胞死を抑制する阻害剤の探索一方、並行してLAAOによる細胞死を抑制する阻害剤の探索を、本学で保管している化合物ライブラリーを用いて行っている。現在、利用できる110化合物で評価を行い、LAAOによる細胞死を約６割まで抑制する化合物を１種類見出した。