レクチン（糖認識ドメイン）表層発現酵母創製技術の確立とバイオ分析技術への新展開

建立在表面表达凝集素（糖识别结构域）的酵母创造技术以及生物分析技术的新进展

• 批准号: 22K05162
• 负责人: 高山 勝己
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Fukui National College of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05162/
• 关键词: 酵母細胞表層工学; マンノース糖鎖認識レクチン; GPIアンカー; 糖鎖認識レクチン; アフィニテイークロマトグラフィー担体; レクチンアレイ分析

本年度の計画は，細胞表層工学技術を用いて酵母Saccharomyces cerevisiae MT8-1株の細胞表層にマンノース結合レクチン（MBL）の糖認識ドメイン（CRD）を発現させるためのプラスミドを構築（pMW MBL/CRD）し，最適な表層発現条件を確立した後、発現の確認を抗体染色による直接蛍光顕微鏡観察により行う事を目的とした．初年度１年間に実施された研究の具体的流れを以下に示す。1）ヒトMBL/CRD（エクソン4領域）遺伝子配列情報をDDBJデータベースから入手し、業者委託によりMBL/CRD遺伝子インサートを合成した。2）酵母表層発現用ベクター（GPIアンカーを介して、酵母細胞表層に任意のタンパク質をN-末を介して発現するためのカセットシャトルベクター：pMWFD）に、MBL/CRD遺伝子配列を持つDNAインサートを、TAKARA社のインフュージョン法を用いて、組込みpMW MBL/CRDプラスミドを構築した。3）大腸菌（DH５α株）にpMW MBL/CRDを形質転換した後、表層発現ベクターの必要量を確保し、続いて酵母MT8-1株に形質転換した。4）pMW MBL/CRD遺伝子配列のシークエンスを業者委託により行い、pMW MBL/CRDが意図した位置に挿入され、配列が設計通りであるか（変異が起こっていないこと）確認を行った。5）酵母用選択培地を用いて（25℃、pH7）で、定常状態まで培養し、酵母細胞を遠心分離により回収した。6）MBL/CRDタンパクが酵母表層に発現されているか確認するために、MBL/CRD配列末端に付加したFLAGタグに、抗FLAG抗体染色を行ってから、蛍光顕微鏡観察を行った。しかしながら、一部の酵母に対して、表層発現が確認されたが殆どの酵母は発現がみられなかった。

今年的计划是构建质粒（PMW MBL/CRD），用于在酵母糖粉的细胞表面上表达甘露糖结合凝集素（MBL）的糖识别域（CRD）（CRD），该细胞表面酿酒酵母MT8-1使用细胞表面工程（PMW MBL/CRD）的表达播放，并在表面上进行了表达，并在酵母糖粉的细胞表面层（PMW MBL/CRD）进行了固定，并在酵母菌表面上表达了糖识别域（CRD），并在酵母中表达了糖识别域（CRD）（PMW MBL/crd），并在酵母中表达了糖识别域（CRD）（PMW）MT8-1染色。在第一年进行的研究的具体流程如下所示。 1）从DDBJ数据库获得人类MBL/CRD（外显子4区）基因序列信息，并由承包商合成MBL/CRD基因插入物。 2）使用Takara输注方法的输注方法，使用具有MBL/CRD基因序列的DNA插入物构建了一个集成的PMW MBL/CRD质粒，该插入物通过N-Termenterinus通过N-TermentInus通过GPI锚定）在酵母表面表达载体中（Cassette Shuttle Shuttle vector：PMWFD：PMWFD表达酵母细胞表面上的任何蛋白质）。 3）用PMW MBL/CRD转化大肠杆菌（DH5α菌株）后，确保了所需量的表面表达载体，然后随后转化为酵母MT8-1菌株。 4）PMW MBL/CRD基因序列是通过承包商测序的，并在预期位置插入PMW MBL/CRD，并确认该序列是设计为设计的（没有发生突变）。 5）使用选择性酵母培养基（25°C，pH 7）将细胞培养为稳态，并通过离心收集酵母细胞。 6）为了确认是否在酵母表面表达MBL/CRD蛋白，在附着在MBL/CRD序列的末端的标志标签上进行抗FLAG抗体染色，然后进行荧光显微镜。但是，一些酵母证实了表面表达，但大多数酵母都没有表达表达。