レクチン（糖認識ドメイン）表層発現酵母創製技術の確立とバイオ分析技術への新展開

本年度の計画は，細胞表層工学技術を用いて酵母Saccharomyces cerevisiae MT8-1株の細胞表層にマンノース結合レクチン（MBL）の糖認識ドメイン（CRD）を発現させるためのプラスミドを構築（pMW MBL/CRD）し，最適な表層発現条件を確立した後、発現の確認を抗体染色による直接蛍光顕微鏡観察により行う事を目的とした．初年度１年間に実施された研究の具体的流れを以下に示す。1）ヒトMBL/CRD（エクソン4領域）遺伝子配列情報をDDBJデータベースから入手し、業者委託によりMBL/CRD遺伝子インサートを合成した。2）酵母表層発現用ベクター（GPIアンカーを介して、酵母細胞表層に任意のタンパク質をN-末を介して発現するためのカセットシャトルベクター：pMWFD）に、MBL/CRD遺伝子配列を持つDNAインサートを、TAKARA社のインフュージョン法を用いて、組込みpMW MBL/CRDプラスミドを構築した。3）大腸菌（DH５α株）にpMW MBL/CRDを形質転換した後、表層発現ベクターの必要量を確保し、続いて酵母MT8-1株に形質転換した。4）pMW MBL/CRD遺伝子配列のシークエンスを業者委託により行い、pMW MBL/CRDが意図した位置に挿入され、配列が設計通りであるか（変異が起こっていないこと）確認を行った。5）酵母用選択培地を用いて（25℃、pH7）で、定常状態まで培養し、酵母細胞を遠心分離により回収した。6）MBL/CRDタンパクが酵母表層に発現されているか確認するために、MBL/CRD配列末端に付加したFLAGタグに、抗FLAG抗体染色を行ってから、蛍光顕微鏡観察を行った。しかしながら、一部の酵母に対して、表層発現が確認されたが殆どの酵母は発現がみられなかった。

本年度の計画は，細胞表層工学技術を用いて酵母Saccharomyces cerevisiae MT8-1株の細胞表層にマンノース結合レクチン（MBL）の糖認識ドメイン（CRD）を発現させるためのプラスミドを構築（pMW MBL/CRD）し，最適な表層発現条件を確立した後、発現の確認を抗体染色による直接蛍光顕微鏡観察により行う事を目的とした．初年度１年間に実施された研究の具体的流れを以下に示す。1）ヒトMBL/CRD（エクソン4領域）遺伝子配列情報をDDBJデータベースから入手し、業者委託によりMBL/CRD遺伝子インサートを合成した。2）酵母表層発現用ベクター（GPIアンカーを介して、酵母細胞表層に任意のタンパク質をN-末を介して発現するためのカセットシャトルベクター：pMWFD）に、MBL/CRD遺伝子配列を持つDNAインサートを、TAKARA社のインフュージョン法を用いて、組込みpMW MBL/CRDプラスミドを構築した。3）大腸菌（DH５α株）にpMW MBL/CRDを形質転換した後、表層発現ベクターの必要量を確保し、続いて酵母MT8-1株に形質転換した。4）pMW MBL/CRD遺伝子配列のシークエンスを業者委託により行い、pMW MBL/CRDが意図した位置に挿入され、配列が設計通りであるか（変異が起こっていないこと）確認を行った。5）酵母用選択培地を用いて（25℃、pH7）で、定常状態まで培養し、酵母細胞を遠心分離により回収した。6）MBL/CRDタンパクが酵母表層に発現されているか確認するために、MBL/CRD配列末端に付加したFLAGタグに、抗FLAG抗体染色を行ってから、蛍光顕微鏡観察を行った。しかしながら、一部の酵母に対して、表層発現が確認されたが殆どの酵母は発現がみられなかった。