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新規酵素によるいもち病菌の植物免疫回避とイネのカウンター防御の分子機構の解明

利用新型酶阐明植物稻瘟病菌免疫逃避和水稻反防御的分子机制

基本信息

批准号：
22K05447
负责人：
大沼貴之
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kindai University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

イネいもち病菌がイネへの感染時、細胞外に分泌する糖質加水分解酵素ファミリー18（GH18）キチナーゼMoChia1を大腸菌を用いて発現させ、Niアフィニテイーおよびゲルろ過クロマトグラフィーによりSDS-PAGEで均一なまでに精製した。本酵素の酵素学的性質を調べた結果、至適pHは5.0、至適温度は40℃であり、pH安定性は5.0～9.5、温度安定性は40℃までであることがわかった。キチンオリゴ糖分解を、TLC(薄層クロマトグラフィー)およびHPLC（高速液体クロマトグラフィー）により解析した結果、本酵素はキチンオリゴ糖3～6糖［(GlcNAc)3-6］を加水分解することがわかった。また、作用様式はGH18キチナーゼとしては異例のエキソ型であった。(GlcNAc)3-6に対する比活性を還元糖定量法により求めたところ、比活性は(GlcNAc)6＞(GlcNAc)5＞(GlcNAc)4＞(GlcNAc)3の順に高く、鎖長が長い基質ほど効率良く分解されることがわかった。ゲルろ過カラムを連結したHPLCを用いた解析により、これまでに(GlcNAc)3と(GlcNAc)5に対する加水分解の速度論的パラメーターを決定した。精製したMoChia1は、576種類の沈殿剤を用いた蒸気拡散法による結晶化に供した。これまでのところ2条件下で0.4 mm 角程度の結晶が得られている。同結晶を用いてX線による構造決定を試みたが、これまでに良質な回折データは得られていない。OsTPR1を大腸菌を用いて発現させ、Niアフィニテイーおよびゲルろ過クロマトグラフィーによりSDS-PAGEで均一なまでに精製した。精製したOsTPR1を用いてMoChia1のpNP-キトビオシドの分解活性に対する阻害活性評価を行ったが、これまでのところ阻害活性は検出されていない。

When the bacteria are infected, extracellular secretion of glucose-hydrolyzing enzyme GH18 (GH18) and MoChia1 is produced in Escherichia coli, Ni is purified uniformly by SDS-PAGE. The enzymatic properties of this enzyme are adjusted to pH 5.0, pH stability 5.0~9.5, temperature stability 40℃. The enzyme was used to decompose sugars 3 - 6 [(GlcNAc)3- 6] by TLC(Thin Layer Chromatography) and HPLC (High Speed Liquid Chromatography). The function is GH18. (GlcNAc)3-6: Specific activity: (GlcNAc)6>(GlcNAc)5>(GlcNAc)4>(GlcNAc)3: High, Low, High, High The HPLC method is used to determine the rate of hydrolysis. The refined MoChia1 was prepared by crystallization of 576 types of additives using the mid-range evaporation method. Under the condition of 2, X-ray diffraction is used to determine the structure of the crystal. OsTPR1 is a highly purified, highly purified, and highly purified form of Escherichia coli. Purified OsTPR1 was used in the pNP-3 phase of MoChia1 to evaluate its catalytic activity.