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新規酵素によるいもち病菌の植物免疫回避とイネのカウンター防御の分子機構の解明

利用新型酶阐明植物稻瘟病菌免疫逃避和水稻反防御的分子机制

基本信息

批准号：
22K05447
负责人：
大沼貴之
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kindai University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

イネいもち病菌がイネへの感染時、細胞外に分泌する糖質加水分解酵素ファミリー18（GH18）キチナーゼMoChia1を大腸菌を用いて発現させ、Niアフィニテイーおよびゲルろ過クロマトグラフィーによりSDS-PAGEで均一なまでに精製した。本酵素の酵素学的性質を調べた結果、至適pHは5.0、至適温度は40℃であり、pH安定性は5.0～9.5、温度安定性は40℃までであることがわかった。キチンオリゴ糖分解を、TLC(薄層クロマトグラフィー)およびHPLC（高速液体クロマトグラフィー）により解析した結果、本酵素はキチンオリゴ糖3～6糖［(GlcNAc)3-6］を加水分解することがわかった。また、作用様式はGH18キチナーゼとしては異例のエキソ型であった。(GlcNAc)3-6に対する比活性を還元糖定量法により求めたところ、比活性は(GlcNAc)6＞(GlcNAc)5＞(GlcNAc)4＞(GlcNAc)3の順に高く、鎖長が長い基質ほど効率良く分解されることがわかった。ゲルろ過カラムを連結したHPLCを用いた解析により、これまでに(GlcNAc)3と(GlcNAc)5に対する加水分解の速度論的パラメーターを決定した。精製したMoChia1は、576種類の沈殿剤を用いた蒸気拡散法による結晶化に供した。これまでのところ2条件下で0.4 mm 角程度の結晶が得られている。同結晶を用いてX線による構造決定を試みたが、これまでに良質な回折データは得られていない。OsTPR1を大腸菌を用いて発現させ、Niアフィニテイーおよびゲルろ過クロマトグラフィーによりSDS-PAGEで均一なまでに精製した。精製したOsTPR1を用いてMoChia1のpNP-キトビオシドの分解活性に対する阻害活性評価を行ったが、これまでのところ阻害活性は検出されていない。

During bacterial infection, extracellular secretion of sugars, hydrolytic enzymes, enzyme 18 (GH18), MoChia1, and Ni were used to detect bacterial infection, Ni and SDS-PAGE were all tested in one step. The results of the enzymology of this enzyme were as follows: pH 5.0, temperature 40 ℃, pH stability 5.0 9.5, temperature stability 40 ℃. The results of the analysis of the results of sugar decomposition, TLC (high-speed liquid chromatography), TLC (high-speed liquid chromatography), glucose decomposition (GlcNAc) 3-6, sugar 3-6 and water decomposition. This is the first example of a GH18-type, functional-type one. (GlcNAc) 3-6 μ mol ·L-1. The specific activity (GlcNAc) 6 > (GlcNAc) 5 > (GlcNAc) 4 > (GlcNAc) 3 was determined by quantitative analysis of specific activity and specific activity. To determine the speed of water decomposition, this paper uses the analytical method (GlcNAc) 3 (GlcNAc) 5 to determine the rate of water decomposition. In order to improve the quality of MoChia1, we use the method of steaming and dispersion to crystallize and supply the samples. Under the condition of temperature 2, the angle angle of 0.4 mm was obtained. In the same result, we use the method of computer simulation to determine the accuracy of the decision, and to make a decision. Both OsTPR1 and Ni products were tested in the same way as those in SDS-PAGE. Fine OsTPR1 was used to determine the decomposition activity of MoChia1, the inhibition activity, the inhibition activity, and the inhibition activity.