AMPDの結晶構造解析による反応機構の解明

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本研究は、Candidatus Promineofilum breve 由来ホスホトランスアンヒドロメバロン酸デカルボキシラーゼ（PbrAMPD）の結晶構造解析による反応機構の解明を目的とし、本年度は各種大腸菌を用いたPbrAMPDの発現条件および精製条件の最適化検討、およびその結晶化条件検討を実施した。組換え型PbrAMPDの発現条件として種々条件検討の結果、大腸菌BL21(DE3)を用い、また培地はLBが最も適している事、発現誘導には２０度が最も適している事を見出した。この発現誘導条件で得られたPbrAMPDの精製条件の種々検討を行ない、最適な溶液条件（リン酸バッファー（pH7.4)+0.3M NaCl + 5％Glycerol)を見出した。その溶液条件を用いた精製の結果、最終精製収量が結晶化を行うに十分量（１０mg以上）を得る精製条件の確立に成功した。またその確立した精製条件により、以前の精製条件では見られたPbrAMPDの凝集が生じる事なく十分に安定した状態を維持していることを確認した。得られた精製PbrAMPDを用いて種々結晶化条件を検討した。その結果、この安定なPbrAMPDを用いることで今まで得られなかった板状のタンパク質結晶を複数の条件で得る事に成功した。前年度の発現・精製条件検討以前に得られていた結晶は針状結晶のみであった一方、本年度の発現・精製条件検討以降では初めて複数条件で板状結晶が得られた事から、この発現・精製条件検討による安定化PbrAMPDの取得が、結晶化の改善に有利に働いたのであろうと考えている。現在は得られた結晶化条件の最適化を進め、2023年度中に結晶構造を決定することを目標として実験を行っている。