Research on the mechanism of reproductive communication between males and females via peptide sex pheromones

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本研究では、異性の性行動を単一分子で誘起し得る雄性フェロモン（ソデフリン）と雌性フェロモン（アイモリン）が共に同定された四肢動物であるアカハライモリをモデルに、雌雄両性の性フェロモン応答処理中枢神経系と、その内分泌学的調節機序の詳細を解析することを目的としている。初年度にあたる本年は以下の5つの実験を行い、それぞれに一定の成果を得た。1. 雄性フェロモンソデフリンのノックアウト(KO)動物の作成：ソデフリンペプチドのコード領域上流にあるPAM配列を認識して当該ゲノムDNA配列に得意的な切断をするガイドRNAとCas9酵素をイモリ受精卵に顕微注入することで、ソデフリン遺伝子にNHEJ（非相同末端結合）の修復ミスに起因するフレームシフトを誘発させ、性フェロモンKO動物(F0)を作成した。今後、交配によって非モザイク性のF1動物を得て、解析を行う予定である。2. 今後の解析に必要なアルビノ個体の準備：ゲノム編集により作成したメラニンを持たないアルビノイモリのF0個体を得て、今後の蛍光シグナルでの解析を容易なものとした。3. イモリのcrystallinプロモーターのクローニング：水晶体で同プロモーター下流の蛍光タンパク質を発現させ、外来遺伝子導入マーカーとして発生初期に遺伝子導入を確認可能となる。4.複数のソデフリンパラログ・神経活動依存的に発現する最初期遺伝子（Egr-1およびArc）プロモーターのクローニング：それぞれ、性フェロモンの発現調節機構の解析や、フェロモン受容応答神経系の同定や解析に利用できる。5. 脳内の神経回路解析に有用な神経細胞標識を達成するBrainBowコンストラクトの作成：複数の蛍光タンパク質の発現を神経細胞ごとにランダムに起こすことで、個々の神経繊維の追跡が可能となるため、今後、同コンストラクトを導入したイモリが応答神経系の同定や解析に利用できる。