Rho活性化因子に対するタンパク質相互作用原理を用いた新規機能調節分子の創成

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過去、RhoGEFの一種であるPLEKHG1のPHドメイン上に、PXXPモチーフが存在し、そのモチーフにアダプタータンパク質の一種である NCK2が結合することにより、PLEKHG1のRhoGEF活性が抑制されることを見出した。このことから、今年度は、計画に従い、まず、他の70種類存在するRhoGEFのPHドメインにPXXPモチーフを持つものが存在するかどうかを確認した。その結果、５種類のRhoGEFのPHドメイン上にPXXPモチーフが存在することがわかり、そのうちの４つについては、PLEKHG1とほぼ同様の位置（PHドメインの開始アミノ酸から数えた場合）にPXXPモチーフが存在することを確認した。それらのRhoGEFに関して、全長クローンを取得し、DH-PHドメインのみの変異体およびPXXPモチーフの変異体などの発現ベクター等を作成し、HEK293細胞において、その発現を確認するとともに、これらの野生型及び変異体が、HEK293細胞において、Rho活性化の指標であるSRF活性を上昇させることも確認した。さらに、NCK2の全長及びSH3ドメインのみを持つNCK2のN末端領域変異体の発現ベクターを用い、それぞれのRhoGEFの活性に対する影響を確かめた結果、予想通り、PLEKHG1を含む５つのRhoGEFにおいて、NCK2との共発現により、SRF活性が抑制された。このことから、予想通り、NCK2によりPHドメインにPXXPモチーフを持つRhoGEFはその活性が抑制されることが示唆された。さらに、これらのRhoGEF及びNCK2それぞれの各種変異体を用いた実験から、RhoGEFとNCK2は、このPHドメイン上のPXXPモチーフを介して相互作用していることも免疫沈降実験等から明らかにできた。