Characterization of mutant adenosine deaminase 2 from the viewpoint of functional conformation

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アデノシンデアミナーゼ（ADA）2欠損症は、アデノシン代謝酵素ADA2をコードする遺伝子の機能喪失変異によって発症する自己炎症性疾患である。ADA2欠損症では、血中ADA2の酵素活性が低下することに不随して、結節性多発動脈炎や免疫・血液学的症状などが現れる。本研究は、機能喪失変異型ADA2の生合成過程における性質を明らかにすることを目的に、細胞内で形成される多様な立体構造と酵素活性発現の関係を解明を目指した。2022年度は、主要な単一アミノ酸変異体のコンストラクトを作成するとともに、その一部について細胞内における分子サイズの比較と薬理シャペロンへの応答性を調べた。まず、一過性に発現させた細胞の溶解液をゲルろ過クロマトグラフィーで分画し、各画分をSDS-PAGE、ウエスタンブロットで解析して二量体形成量を評価した。また、blue native PAGEによる分子サイズ評価系も構築し、同様の実験系で二量体形成量を評価した。さらに、それぞれの変異体の安定性をthermal shift assayにより評価するため、バッファー、リガンドなどの諸条件を検討し、熱変性温度（Tm）に関し予備的結果を得た。また、薬理シャペロンによる変異型ADA2の凝集阻害および分泌量に及ぼす効果を調べるため、一部の変異体において数種類の薬理シャペロンを単独あるいは組み合わせで用いて効果を比較し、最適な組み合わせおよび濃度を検討した。