2光子励起顕微鏡による自家蛍光を指標とした新規膵癌画像診断法の開発

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2光子励起顕微鏡による癌診断の有用性を明らかにするため、本年度は、2光子励起顕微鏡を用いて未固定、未染色で①培養細胞を用いた観察条件の決定、②培養細胞における自家蛍光量の解析、③手術検体における線維化領域の検出を行った。培養細胞を用いた実験では、膵癌細胞株(PANC-1, PK-1, PK-8, PK-45P)、不死化膵管上皮細胞株(HPDE6)、線維芽細胞株(HFL-1)を用いて、過去の検討結果を参考に、励起波長720，760，860，900nm、検出波長410～581nmにおける自家蛍光像を撮影し、画像解析を行った。すべての細胞において励起波長760nm、検出波長410～495nmにおいて最も強く自家蛍光を認めた。PANC-1ではHPDE6と比較して細胞質の自家蛍光輝度が有意に高値であり、核周辺に凝集していた。また、膵癌細胞株による比較ではPANC-1とPK-8の自家蛍光輝度が他の細胞株と比較して有意に高値であった。また、HFL-1では励起波長760nmに加え860，900nm、検出波長541～581nmでも自家蛍光像を得ることができた。これらの結果より、癌細胞、非癌細胞、線維芽細胞を自家蛍光像で区別できる可能性が示唆された。手術検体を用いた実験では、癌部と非癌部の膵組織を励起波長860nm、検出波長460～500nmで観察し青色の蛍光像を得た。観察後の組織を10％中性緩衝ホルマリンで固定後、組織標本を作製し、HE染色とアザン染色を行った。二光子励起顕微鏡での検出領域はアザン染色における線維化領域と相関していた。また、癌部では非癌部よりも線維化の領域が有意に増加していた。このことから、二光子励起顕微鏡を用いることにより固定、染色をせずに組織の線維化を評価することが可能であることが示唆された。