深在性真菌症のFFPE組織を用いた分子形態学的な同定および解析方法の確立

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深在性真菌症は致死的な経過をたどるが、微生物検査での真菌の検出率は50％以下と低い。また、病理組織診断での真菌の同定は形態診断にとどまっており、患者の適切な治療導入に対応できていない。申請者は、原因不明の肺炎で死亡し、病理解剖で深在性真菌症の診断となった症例を経験した。超微細構造観察と菌叢解析の結果、病巣では複数の真菌により真菌叢を形成していた。以上のような背景から、深在性真菌症の同定・解析手法の確立を通して、病態理解を深め、治療成績を向上させたいと考え、本研究を想起した。本研究課題達成のため、深在性真菌症のホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織を用いて、①走査型電子顕微鏡（SEM）による真菌の超微細構造の観察・同定、②抽出DNAを用いたシークエンス法による同定および、③次世代シーケンサーを用いた真菌叢解析(メタゲノム解析)、④真菌由来抽出タンパク質を用いたプロテオーム解析を行う。本研究は、深在性真菌症を、非培養的、多層的、網羅的に解析し、その病態を明らかにすることで、適切な治療法選択、新たな治療戦略創出への寄与を目指す。これまでに、深在性真菌症の解剖症例を用いて、FFPE組織からSEM観察標本の条件検討を実施した。FFPE組織から、様々な厚さの薄切標本を作成し、様々な標本作成条件を試み、SEM観察標本を作成した。SEM S-4300 (HITACHI), TM4000Plus (HITACHI)を用いて、観察を行い、アスペルギルス、カンジダの菌体観察に成功した。立体構造観察には、厚さ15-30umが適していた。また、アスペルギルスニガー感染症例で、シュウ酸カルシウム結晶を多数沈着している領域で、SEM-EDSを用いた、二次元元素マッピングを行ったところ、カルシウムの分布が、結晶沈着と一致して観察され、SEM-EDSの有用性が確認された。