病原ビブリオの温度センサーシステムの機能解析

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汽水から海水に生息するビブリオ・バルニフィカスは、26℃（夏季の海水温）ではプロテアーゼVvsAを大量に生産・分泌する。しかし37℃（ヒトの体温）ではVvsAを殆ど生産・分泌しない。つまり、この細菌は環境温度を感知するセンサーシステムを備えている。令和4年度は、温度上昇の感知に関与するセンサー蛋白質を探索するため、野生株のトランスポゾンTn10変異株ライブラリーから、温度変化を感知できず、37℃でも十分量のVvsAを生産・分泌する変異株を選抜し、Tn10が挿入された遺伝子を同定した。Tn10挿入変異株ライブラリーを1％スキムミルク添加寒天培地に接種し、26℃あるいは37℃で2～4日間培養した。そして、常に、37℃でもVvsAを生産・分泌し、スキムミルクを分解して、コロニーの周囲にクリアゾーンを形成する安定な変異株を16個選抜した。次に、選抜した変異株を26℃あるいは37℃で振とう培養し、37℃において、26℃と同程度以下の増殖を示した変異株14個を二次選抜した。さらに、低温環境に曝露後も低温ショック蛋白質の遺伝子cspAの発現が誘導されないことを確認した。26℃あるいは14℃に1時間曝した後、cspAのmRNA量をRT-qPCR法で測定した。その結果、12個の変異株では、14℃に曝されてもcspAのmRNA量は増加しなかった。以上の選抜操作によって、温度センサーシステムが機能していないと考えられる変異株を12個得ることができた。選抜した12個の変異株からゲノムDNAを精製し、genome walkingによってTn10に隣接する領域をPCR増幅したところ、11個の変異株では明瞭なPCR増幅物が得られた。次いで、PCR増幅物の塩基配列を解析し、BLAST検索を行った。その結果、9個の変異株については、Tn10が挿入された遺伝子を同定することができた。