RAN翻訳を抑制するRGq核酸の開発研究

抑制RAN翻译的RGq核酸的研发

• 批准号: 22K07366
• 负责人: 石黒 太郎
• 金额: $ 0.25万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07366/
• 关键词: G quadruplex; 核酸医薬; 神経変性疾患

本研究はRAN翻訳開始地点より上流配列にRGqを誘起することが出来れば，RAN翻訳蛋白の発現量を抑制することが可能となるのではないか考え、RGqを誘導する手段としてDNAorigamiを応用することから着想した。そこで本研究にて明らかにしようとする第一段階ではSCA31(TGGAAリピート、本邦で高頻度)、C9orf72-ALS/FTD(GGGGCCリピート、世界で高頻度)の２疾患に対してRGq核酸を設計し、すでに作成した疾患モデル培養細胞を用いてRAN翻訳抑制効果の高い核酸配列を決定することである。2022年度はSCA31において疾患リピートの上流に位置する複数のGGG配列を標的とし、RAN翻訳を抑制するRGq核酸をスクリーニングした。RGq核酸を複数デザインし、in vitroにおいていずれもデザインした核酸のチオフラビンを用いたG-quadruplex形成評価およびStop assayによる標的RNA上でのRGq形成を確認した。具体的には、SCA31のBEAN1のイントロン内のUGGAAリピートを含む領域の5'側に２０塩基前後でハイブリダイズするASOをデザインした。加えてこのASOにG-rich配列をテザリングした核酸を合成し、目的の標的RNA上のGGG配列上でG-quadruplexが形成されたことが確認された。またRAN翻訳についても培養細胞を用いた系にimmunoblotにより評価してタンパク発現抑制を確認した。今後ははさらなる①核酸配列の最適化、②化学修飾の最適化が必要であるが、現段階ではFISHによるRNA fociの評価も実施検討中である。

In this study, the expression of RAN protein was inhibited by means of upstream alignment. In the first stage of this study, two diseases, SCA31(TGGAA) and C9orf72-ALS/FTD(GGCC), were identified. In 2022, a number of GGG alignment targets were identified in SCA31. RGq nucleic acid complex analysis, in vitro analysis, G-quadruplex analysis, and Stop assay were used to determine RGq formation on target RNA. Specifically, the SCA31 BEAN1 has a 5'-side ASO. Add G-rich alignment to DNA synthesis, G-quadruplex alignment to target RNA, and confirm. The expression of RNA in cultured cells was determined by immunoblot assay. In the future, optimization of nucleic acid alignment, optimization of chemical modification, and evaluation of RNA foci at the current stage will be discussed.