Detection of ALS origin with reference to calcium-binding proteins, those generate glial inflammation

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①研究計画書に基づき、カルシウム結合蛋白 (カルビンディン, CB; カルレチニン, CR; パルブアルブミン, PV)によるグリア性炎症惹起性の検証を以下の方法で行った。マウス株化ミクログリア6-3細胞 (COSMO BIO Co.LTD)を96ウェルプレートに播種した後、培養液にエンドトキシンフリーであることを確認したリコンビナント蛋白、CB、CR、PV (0, 1, 10, 100 nM)を添加しday1-3の各培養上清に含まれる17種類のケモカイン/サイトカイン（CXCL1, GM-CSF, IFNγ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, MCP1, MIP1a, MIP1b, TNF-α）をFirePlex-96 Key Cytokines (Mouse)Immunoassay panel (Abcam, ab235656)で測定した。測定前に各dayにおいて細胞をパラフォルムアルデヒド固定しクリスタルバイオレット染色を行い、細胞の生存を確認した。この結果、測定した全項目の中で100 nM、day3のCR添加群においてMCP1の有意な増加を認めた (測定値は②に示す（pg/ml）。両側t検定；無添加群 vs. 100 nM: p=0.040, 1 nM vs. 100 nM: p=0.033, 10 nM vs. 100 nM: p=0.045)。残り16項目のケモカイン/サイトカインについて有意な変動はなかった。 CB、PV添加群では一部の検体で測定値が得られたがばらつきが大きく判定不可とした。②(無添加群)118.4±21.8,　(1nM)177.6±20.9, (10nM)190.0±25.1, (100nM)328.5±79.2