ALS発症におけるOPTNの新規核内機能：スプライソソーム異常と凝集体形成

OPTN部分欠失体Lc2ndが培養細胞の核内でスプライソソーム複合体の蛋白と結合し、この中にALS原因遺伝子FUSも同定されたことから、核内OPTNの核内局在の意義とALS発症メカニズムを、FUS機能の修飾（促進あるいは抑制）とする視点で検討をおこなった。１）核内機能の追究：HeLaS3細胞および、OPTN正常遺伝子、部分欠失体Lc2ndを安定発現する細胞からcDNAライブラリーを作成した。FUSにより選択的スプライシングを受ける遺伝子をターゲットとして、特異的プライマーでPCRを行ない、MAPTでは、Ex10を含み４個の微小管結合配列を持つ4Repeat-tau（4RT）と、これを含まない3Repeat-tauに相当するバンドを得た。Lc2ndの場合にのみ、4RTバンドの強度が増加した。他に、複数の選択的スプライシングが変わる遺伝子が存在した。また、FUSにより発現制御をうけるLong pre-mRNAのいくつかの発現をみとめた。２）凝集体形成へのOPTNの寄与の検討：GFP融合FUS遺伝子プラスミドと患者で発見されている変異を導入した改変プラスミドを、HeLaS3細胞および,OPTN,Lc2nd発現細胞株へ遺伝子導入し、24時間後に細胞質凝集体を観察した。Gly-richドメイン、核局在シグナルの変異を用いた。Lc2nd発現細胞では、複数の変異に細胞質凝集体の増加が見られた。３）ALS発症時のOPTNの核局在の実証：酸化ストレス刺激により、正常OPTNの核移行をみとめ、核移行のキーとなる刺激を得た。また、Lc2ndが欠失している領域を発現させることで、内在OPTNの核移行を示す結果から、この領域に応答性因子が結合すると推測する。今回、核内局在を示すOPTN短縮体Lc2ndが、FUS欠損の場合の選択的スプライシングを模倣し、また、変異FUSで見られる細胞質凝集体形成を促進するという結果を得た。すなわち、核内OPTNは、ALS発症を促進する可能性が示唆された。

OPTN部分欠失体Lc2ndが培養細胞の核内でスプライソソーム複合体の蛋白と結合し、この中にALS原因遺伝子FUSも同定されたことから、核内OPTNの核内局在の意義とALS発症メカニズムを、FUS機能の修飾（促進あるいは抑制）とする視点で検討をおこなった。１）核内機能の追究：HeLaS3細胞および、OPTN正常遺伝子、部分欠失体Lc2ndを安定発現する細胞からcDNAライブラリーを作成した。FUSにより選択的スプライシングを受ける遺伝子をターゲットとして、特異的プライマーでPCRを行ない、MAPTでは、Ex10を含み４個の微小管結合配列を持つ4Repeat-tau（4RT）と、これを含まない3Repeat-tauに相当するバンドを得た。Lc2ndの場合にのみ、4RTバンドの強度が増加した。他に、複数の選択的スプライシングが変わる遺伝子が存在した。また、FUSにより発現制御をうけるLong pre-mRNAのいくつかの発現をみとめた。２）凝集体形成へのOPTNの寄与の検討：GFP融合FUS遺伝子プラスミドと患者で発見されている変異を導入した改変プラスミドを、HeLaS3細胞および,OPTN,Lc2nd発現細胞株へ遺伝子導入し、24時間後に細胞質凝集体を観察した。Gly-richドメイン、核局在シグナルの変異を用いた。Lc2nd発現細胞では、複数の変異に細胞質凝集体の増加が見られた。３）ALS発症時のOPTNの核局在の実証：酸化ストレス刺激により、正常OPTNの核移行をみとめ、核移行のキーとなる刺激を得た。また、Lc2ndが欠失している領域を発現させることで、内在OPTNの核移行を示す結果から、この領域に応答性因子が結合すると推測する。今回、核内局在を示すOPTN短縮体Lc2ndが、FUS欠損の場合の選択的スプライシングを模倣し、また、変異FUSで見られる細胞質凝集体形成を促進するという結果を得た。すなわち、核内OPTNは、ALS発症を促進する可能性が示唆された。