薬剤耐性・変異株解析可能なリアルタイム次世代シークエンスによる重症感染症迅速診断

使用实时下一代测序快速诊断严重传染病，从而分析耐药性和突变株

• 批准号: 22K07818
• 负责人: 伊藤 嘉規
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Nihon University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07818/
• 关键词: 次世代シークエンス; リアルタイムシークエンス法; ロングリード法; 重症感染症; 病原微生物診断; リアルタイムシークエンス; 薬剤耐性; ウイルス変異株; 感染症診断

重症感染症では、早期診断と適切な抗微生物薬の選択が予後を左右する。そのため、感染症病原診断に現時点で最も優れた可能性をもつロングリード法(5-20kbpの遺伝子断片を解析)・次世代シークエンス法による新規診断法の開発を行う。遺伝子断片の網羅的解析を行うことから、解析検体中のマイクロバイオーム、病原微生物の薬剤耐性遺伝子、ウイルスの変異株を平行して解析可能である。ロングリード法に使用するナノポアシークエンサーは、遺伝子配列の解析に同時平行して解析情報を見ることが可能なため、短時間で微生物を同定することが可能であり「リアルタイムシークエンス法」と表現できる。リアルタイムシークエンス法では、6時間程度で、薬剤耐性情報を含む網羅的な微生物診断が可能となる。ナノポアシークエンサーには、解読精度がショートリードより劣る欠点があり、臨床応用可能なプロトコールの開発が不十分な状況であるが、技術改良が進んでいる。本研究では、重症感染症の網羅的・迅速診断法としてのリアルタイムシークエンス法の基盤的検証を行う。2022年度は、人工呼吸器管理を要した小児重症呼吸不全患者10例の気管支肺胞洗浄液からRNAを抽出し、リアルタイムシークエンス法およびショートリードシークエンス法で解析し、比較検討した。リアルタイムシークエンス法/ショートリードシークエンス法ともに同一の6例でRSウイルス、エンテロウイルスなどが検出された。リアルタイムシークエンス法とショートリードシークエンス法で総塩基数を揃えた後に、各ウイルスのgenome coverageを比較したところ、リアルタイムシークエンス法が高いcoverageを示すものが多かった。

在严重的感染中，早期诊断和选择适当的抗菌剂会影响预后。因此，我们将使用长阅读方法（分析5-20KBP基因片段）和下一代测序方法开发新的诊断方法，该方法目前具有传染病病原体的最佳潜力。在分析的样品中，对基因片段的全面分析使得可以分析微生物组，致病性微生物的耐药性基因和病毒的突变菌株。长阅读方法中使用的纳米孔测序仪可以通过基因序列的分析同时查看分析信息，从而可以在短时间内鉴定微生物，并且可以描述为“实时测序方法”。实时测序方法允许在大约6小时内进行全面的微生物诊断，包括耐药性信息。纳米孔测序仪的缺点是，其解密精度不如简短读取，并且临床适用的协议的开发不足，但是技术正在改进。这项研究将从根本上研究实时测序方法，作为严重传染病的详尽而快速诊断。在2022财年，从10名患有严重呼吸衰竭的儿童的支气管肺泡灌洗液中提取RNA，需要呼吸器管理，并使用实时测序和短阅读测序进行分析，并进行比较和检查。在实时测序和短阅读测序方法中，在相同的六个情况下检测到RS病毒，肠病毒等。在使用实时测序方法和短阅读测序方法匹配总基数之后，在比较每个病毒的基因组覆盖范围时，许多实时测序方法都显示出较高的覆盖范围。