αアクチニン3欠損はDMD患者のiPS由来心筋細胞においてタイチン分解を促進する

本年度は末梢単核球由来細胞からiPS細胞を樹立、iPS細胞の心筋細胞への分化について実験を行った。初めに、iPS細胞樹立から心筋分化のプロトコールの決定のため、健常人サンプルを用いて実験を行った。健常人の末梢血単核球に、センダイウイルスベクターを用いて４因子（Klf-4, Oct3/4, Sox2, C-myc）を導入し培養を行った。マーカー遺伝子の発現の確認を行い、iPS細胞を樹立できることを確認した。次に、樹立したiPS細胞から心筋細胞へ分化の検討を行った。当初は、心筋の成熟マーカーの発現が弱い心筋細胞のみ得られ、成熟度が高い心筋細胞を得ることが困難であった。また、結合組織や血管細胞と思われる心筋以外の細胞も発生する問題があった。そのため、培地の選択、培養液の組成や培養条件の組み合わせについて何度も検討を行ったところ、成熟マーカーの発現があり、拍動が確認される成熟心筋細胞を得れた。これによりiPS細胞から心筋細胞への分化プロトコールの決定ができた。次に、Duchenne型筋ジストロフィーの患者３名から末梢血を採取した。３名の内訳は、αアクチニン3欠損患者が１名、非欠損患者が２名である。このうち、αアクチニン3非欠損患者1名においてiPS細胞のマーカー遺伝子の発現や三胚葉分化について評価が終了し、iPS細胞を樹立している。もう一人の非欠損患者については、マーカーや分化の確認を行っている。欠損患者は現在細胞の培養中である。iPS細胞を樹立した患者では、決定した分化プロトコールを用い心筋細胞に分化を行った。

本年度は末梢単核球由来細胞からiPS細胞を樹立、iPS細胞の心筋細胞への分化について実験を行った。初めに、iPS細胞樹立から心筋分化のプロトコールの決定のため、健常人サンプルを用いて実験を行った。健常人の末梢血単核球に、センダイウイルスベクターを用いて４因子（Klf-4, Oct3/4, Sox2, C-myc）を導入し培養を行った。マーカー遺伝子の発現の確認を行い、iPS細胞を樹立できることを確認した。次に、樹立したiPS細胞から心筋細胞へ分化の検討を行った。当初は、心筋の成熟マーカーの発現が弱い心筋細胞のみ得られ、成熟度が高い心筋細胞を得ることが困難であった。また、結合組織や血管細胞と思われる心筋以外の細胞も発生する問題があった。そのため、培地の選択、培養液の組成や培養条件の組み合わせについて何度も検討を行ったところ、成熟マーカーの発現があり、拍動が確認される成熟心筋細胞を得れた。これによりiPS細胞から心筋細胞への分化プロトコールの決定ができた。次に、Duchenne型筋ジストロフィーの患者３名から末梢血を採取した。３名の内訳は、αアクチニン3欠損患者が１名、非欠損患者が２名である。このうち、αアクチニン3非欠損患者1名においてiPS細胞のマーカー遺伝子の発現や三胚葉分化について評価が終了し、iPS細胞を樹立している。もう一人の非欠損患者については、マーカーや分化の確認を行っている。欠損患者は現在細胞の培養中である。iPS細胞を樹立した患者では、決定した分化プロトコールを用い心筋細胞に分化を行った。