グルコース輸送体を標的とした新規オミクス解析による大腸癌の腫瘍免疫制御機構の解明

通过针对葡萄糖转运蛋白的新型组学分析阐明结直肠癌的肿瘤免疫控制机制

• 批准号: 22K07989
• 负责人: 久保田 英嗣
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07989/
• 关键词: 大腸がん; グルコース輸送体; 癌免疫; 癌微小環境; 免疫細胞

本年度は、腫瘍微小環境の免疫細胞におけるグルコース輸送体の発現を解析した。マウス大腸がん細胞CT26をBALB/cマウスの皮下に移植し、形成された腫瘍を摘出し、酵素処理により単細胞懸濁液に調整した。腫瘍から調整した単細胞懸濁液を免疫細胞の表面マーカー抗体（CD3, CD4, CD8, CD11b, CD25, FoxP3）で染色し、フローサイトメトリーによりCD８陽性T細胞、制御性T細胞を分画分取した。単離した免疫細胞からmRNAを抽出し、PCRによりグルコース輸送体の発現を検討した。既存の報告と同様に、CD８陽性T細胞、制御性T細胞に、SGLT2、GULT1などの発現を認めた。発現レベルは細胞により異なっていた。次に、発現を認めたグルコース輸送体のsiRNAを用いてエフェクターT細胞のグルコース輸送体をkock downし、免疫細胞の不応性に関連する、PD-1、CTLA-4、Tim3などの発現の変化をPCRを用いて検討した。in vitroの検証では、グルコース輸送体のkockdownによる、明らかな免疫細胞の不応性に関わる因子の誘導は確認できなかった。その他に予定していた分画分取した免疫細胞の機能検査については、in vitroでの免疫細胞の培養が困難であること、また、免疫細胞のviabilityが乏しいため、良好な条件での実験の遂行が困難で、十分なデータを取得することができなかった。その一例としては、siRNAによるグルコースのkockdownによる、細胞増殖への影響や、細胞死誘導の有無などついての評価は困難であった。

今年，我们分析了肿瘤微环境中免疫细胞中葡萄糖转运蛋白的表达。将小鼠结肠癌细胞皮下植入BALB/C小鼠，并通过酶促处理去除形成的肿瘤并制备成单细胞悬浮液。用免疫细胞的表面标记抗体（CD3，CD4，CD8，CD8，CD11B，CD25，FOX2，FOXP3）和CD8阳性T细胞染色，通过流式细胞仪分馏。从分离的免疫细胞中提取mRNA，并通过PCR研究了葡萄糖转运蛋白的表达。与现有报告一样，在CD8阳性T细胞和调节性T细胞中观察到SGLT2，Gult1之类的表达。细胞之间的表达水平有所不同。接下来，使用效应T细胞中的葡萄糖转运蛋白使用已表达的葡萄糖转运蛋白的siRNA，并使用PCR研究与免疫细胞折射率有关的表达变化，例如PD-1，CTLA-4，TIM3等。体外验证并未证实葡萄糖转运蛋白Kockdown涉及免疫细胞难治的明显因素的诱导。关于分离免疫细胞的计划的功能测试，由于难以在体外培养免疫细胞和免疫细胞的生存能力，因此很难在良好的条件下进行实验，并且无法获得足够的数据。例如，很难评估siRNA葡萄糖kockdown对细胞增殖的影响以及是否诱导细胞死亡。