Analysis of mechanisms for atopic dermatitis-like phenotype resulting from SREBF1 gene mutations

点击翻译按钮获取中文摘要

令和4年度は、事前に作製してあったSREBP-1の野生型および2種類の変異型（p.R527Hおよびp.R527C）の発現ベクター（N末端にFlag-tagを導入）を培養細胞（HEK293T）にトランスフェクションし、細胞溶解液を回収後に抗Flag抗体を用いてwestern blot（WB）法を実施した。しかしながら、予想されるほどの発現量を認めなかった。そこで、tagの数を増やし、さらに開始コドンの上流にKozak配列を導入した新たな発現ベクターを作製し、同様の過剰発現系でWB法を行った結果、野生型・変異型ともに十分な発現量を確認できた。その後、脂質の成分を除去したウシ胎児血清を用いてHEK293T細胞を培養した条件でベクターをトランスフェクションし、過去の論文に記載された手法に従ってステロール非存在下でのSREBP-1の発現をWB法で解析したが、野生型と変異型のいずれにおいてもSREBP-1のN末端の切断および細胞核内への移行を確認することができなかった。現在、予想通りの結果が得られなかった理由を慎重に検討し、さまざまな条件下での追加実験を計画している。また、令和4年度中に患者の頭髪を電子顕微鏡で詳細に観察したところ、頭髪径が周期的に異常に細くなる連珠毛を呈していることが確認できた。さらに、抜去した成長期毛包からtotal RNAを抽出し、逆転写反応でfirst-strand cDNAを作製後にリアルタイムPCR法で毛髪に発現する複数の遺伝子の発現量を健常人と比較した結果、患者では明らかに毛ケラチン遺伝子の発現量が低下していることが明らかになった。