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進行性メラノーマの腫瘍免疫原性再プログラム化とその分子標的研究

晚期黑色素瘤的肿瘤免疫原性重编程及其分子靶点研究

基本信息

批准号：
22K08437
负责人：
村上孝
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Saitama Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08437/
关键词：
腫瘍免疫メラノーマ分子標的免疫原性

项目摘要

進行性悪性黒色腫（メラノーマ）の治療抵抗性の最大の要因は、その腫瘍内微小環境における著しい免疫応答性の低さにある。その腫瘍免疫原性を再プログラム化して治療奏効性を劇的に改善させる方法として、我々はサルモネラ菌のメラノーマ細胞内感染による細胞変性が腫瘍免疫原性を亢進する性質を明らかにしている。本研究では、この分子論的な仕組みを明らかにし、腫瘍免疫原性再編のスイッチ分子を求めるものである。当該年度では、分子標的を絞り込むため、CRISPR/Cas9ゲノム編集による機能的ゲノム・スクリーニングを実施した。まずCas9発現SK-MEL-28（SK-MEL-28-Cas9）メラノーマ細胞に約19,000遺伝子に対するsgRNA(4種類/遺伝子)を発現するレンチウイルスベクターを感染した細胞株ライブラリーを作製した。1次スクリーニングとして赤色蛍光タンパク質tdTomatoで標識したサルモネラ菌株を作製したライブラリー細胞内感染させ、細胞変性を回避して生き残った細胞を回収した。生存細胞を用いて同様にサルモネラ菌の細胞内感染を実施し、さらに2次スクリーニングを行った。これら2次スクリーニングの生存SK-MEL-28-Cas9細胞からゲノムDNAを抽出し、生存細胞で濃縮されているsgRNA配列情報を次世代シークエンサー(NGS)解析によって遺伝子抽出を行った。非スクリーニング群と比較して2セット実験群を解析し、NGSリード数が共通して多い遺伝子リストを作製した。これらのうち上位リストは標的スイッチ遺伝子候補となりうることから、それぞれの標的遺伝子破壊を順次進め、機能分子群の絞り込みを進めたい。

The most important reason for treatment resistance of progressive melanoma is the microenvironment in the tumor. Methods for improving the immunogenicity of tumor cells and the properties of tumor immunogenicity in vivo are described. In this study, molecular reprogramming of tumor immunogenicity was studied. CRISPR/Cas9 is the first time that CRISPR/Cas9 has been published. Cas9 develops SK-MEL-28 (SK-MEL-28-Cas9), a protein that contains approximately 19,000 genes (4 species/gene) and is responsible for the production of sgRNA in infected cell lines. 1. The identification of the cell strain and the prevention of intracellular infection. The intracellular infection of living cells was carried out in the same way as that of living cells. The second generation of SK-MEL-28-Cas9 cells was analyzed by DNA extraction and sgRNA alignment information extraction from survival cells. Compared with the non-Scrutinization group, the 2-site real-time group is analyzed, and the NGS specifications are common, and many genetic information is created. In this case, the functional molecule group is divided into two groups: functional molecule group and functional molecule group.