進行性メラノーマの腫瘍免疫原性再プログラム化とその分子標的研究

進行性悪性黒色腫（メラノーマ）の治療抵抗性の最大の要因は、その腫瘍内微小環境における著しい免疫応答性の低さにある。その腫瘍免疫原性を再プログラム化して治療奏効性を劇的に改善させる方法として、我々はサルモネラ菌のメラノーマ細胞内感染による細胞変性が腫瘍免疫原性を亢進する性質を明らかにしている。本研究では、この分子論的な仕組みを明らかにし、腫瘍免疫原性再編のスイッチ分子を求めるものである。当該年度では、分子標的を絞り込むため、CRISPR/Cas9ゲノム編集による機能的ゲノム・スクリーニングを実施した。まずCas9発現SK-MEL-28（SK-MEL-28-Cas9）メラノーマ細胞に約19,000遺伝子に対するsgRNA(4種類/遺伝子)を発現するレンチウイルスベクターを感染した細胞株ライブラリーを作製した。1次スクリーニングとして赤色蛍光タンパク質tdTomatoで標識したサルモネラ菌株を作製したライブラリー細胞内感染させ、細胞変性を回避して生き残った細胞を回収した。生存細胞を用いて同様にサルモネラ菌の細胞内感染を実施し、さらに2次スクリーニングを行った。これら2次スクリーニングの生存SK-MEL-28-Cas9細胞からゲノムDNAを抽出し、生存細胞で濃縮されているsgRNA配列情報を次世代シークエンサー(NGS)解析によって遺伝子抽出を行った。非スクリーニング群と比較して2セット実験群を解析し、NGSリード数が共通して多い遺伝子リストを作製した。これらのうち上位リストは標的スイッチ遺伝子候補となりうることから、それぞれの標的遺伝子破壊を順次進め、機能分子群の絞り込みを進めたい。

進行性悪性黒色腫（メラノーマ）の治療抵抗性の最大の要因は、その腫瘍内微小環境における著しい免疫応答性の低さにある。その腫瘍免疫原性を再プログラム化して治療奏効性を劇的に改善させる方法として、我々はサルモネラ菌のメラノーマ細胞内感染による細胞変性が腫瘍免疫原性を亢進する性質を明らかにしている。本研究では、この分子論的な仕組みを明らかにし、腫瘍免疫原性再編のスイッチ分子を求めるものである。当該年度では、分子標的を絞り込むため、CRISPR/Cas9ゲノム編集による機能的ゲノム・スクリーニングを実施した。まずCas9発現SK-MEL-28（SK-MEL-28-Cas9）メラノーマ細胞に約19,000遺伝子に対するsgRNA(4種類/遺伝子)を発現するレンチウイルスベクターを感染した細胞株ライブラリーを作製した。1次スクリーニングとして赤色蛍光タンパク質tdTomatoで標識したサルモネラ菌株を作製したライブラリー細胞内感染させ、細胞変性を回避して生き残った細胞を回収した。生存細胞を用いて同様にサルモネラ菌の細胞内感染を実施し、さらに2次スクリーニングを行った。これら2次スクリーニングの生存SK-MEL-28-Cas9細胞からゲノムDNAを抽出し、生存細胞で濃縮されているsgRNA配列情報を次世代シークエンサー(NGS)解析によって遺伝子抽出を行った。非スクリーニング群と比較して2セット実験群を解析し、NGSリード数が共通して多い遺伝子リストを作製した。これらのうち上位リストは標的スイッチ遺伝子候補となりうることから、それぞれの標的遺伝子破壊を順次進め、機能分子群の絞り込みを進めたい。